[發明專利]檢測MGMT基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法

無效

• 申請號: 201310537612.X
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103571958A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 劉曉峰;程宇;侯然;朱立文;梁超;王緒華;方國偉;黃士昂;陳忠
• 申請（專利權）人: 北京海思特臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及基因檢測的引物和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法

背景技術

烷化劑是一種常見的誘變和致癌物質，烷化劑上許多活性基團能和DNA形成許多加合物，其中特別容易和鳥嘌呤形成O⁶-甲基鳥嘌呤，O⁶-甲基鳥嘌呤如果不能被及時發現和糾正，那么在DNA復制過程中，可能會使復制難以繼續或者使復制發生突變，使基因組的序列發生改變，影響基因的表達。O⁶-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（O⁶-methylguanine-DNA?methyltransferase,MGMT）是一種DNA修復酶，可以特異性修復因烷化劑導致的細胞損傷，是哺乳動物細胞修復烷化劑所造成DNA損傷的一個重要環節。如果腫瘤細胞中的MGMT水平過高可能會導致耐藥，但對于正常細胞亦能減少其化療的毒副作用，因此如何控制MGMT水平以達到最佳的化療效果，是當今的一個研究熱點。

MGMT基因結構功能的異常，特別是啟動子過甲基化和腫瘤發生以及生物學上的聯系，正成為關注的焦點。啟動子區過甲基化是引起基因沉默的主要機制之一，可能影響基因功能的正常發揮。大量研究表明，MGMT基因甲基化與替莫唑胺（TMZ）療效相關，MGMT基因啟動子甲基化患者組生存時間明顯長于非甲基化組。

目前甲基化的檢測方法有多種，如甲基化敏感的限制性內切酶-PCR/Southern法、直接測序法、甲基化特異性PCR（methylation-specific?PCR,MSP）-電泳等。MGMT基因甲基化檢測最常用的是MSP，該方法操作方便、適用性廣，靈敏度約為10%。直接測序法的靈敏度低，要求受檢材料的突變比例大于20%，且檢測成本也較高。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物，本發明還公開了包括有該引物的試劑盒及其使用方法。

本申請的發明人根據人類MGMT基因啟動子區域序列設計特異性引物，通過巢式PCR擴增結合DHPLC（變性高效液相色譜分析）檢測，可以快速、準確、高靈敏度地檢測MGMT基因甲基化。

根據本發明的實施例，提供了一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物，所述引物序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:6所示。

根據本發明的實施例，還提供了一種用于檢測MGMT基因甲基化的試劑盒，其主要包括：1）上述用于檢測MGMT基因甲基化的引物，所述引物序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:6所示；2)甲基化處理試劑、PCR?MIX反應液、去離子水、空白對照；3）分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。優選的，上述引物的濃度均為10pmol/μl。

其中，甲基化處理試劑可從北京天漠科技開發有限公司購買得到，其包括CT?Conversion?Reagent、M-Binding?Buffer、M-Wash?Buffer、M-Desulphonation?Buffer、M-Elution?Buffer、Zymo-Spin?IC^TMColumn和Collection?Tube。

其中，PCR?MIX反應液為本領域常規的PCR?MIX反應液；優選的，所述PCR?MIX反應液包括Taq?DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq?DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400μM，所述MgCl2的濃度為3mM。本發明的引物和試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

（1）使用常規方法提取待測樣本的基因組DNA；

（2）對DNA進行亞硫酸鹽處理；

（3）進行巢式PCR：第一次PCR擴增以亞硫酸鹽處理后的DNA為模板，使用的引物序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示；將第一次PCR擴增的產物稀釋20倍作為模板，分兩管進行第二次PCR擴增，A管使用的引物序列如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；B管使用的引物序列如SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示；