[發(fā)明專利]檢測MGMT基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310537612.X
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103571958A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設計）人: 劉曉峰;程宇;侯然;朱立文;梁超;王緒華;方國偉;黃士昂;陳忠
• 申請（專利權）人: 北京海思特臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京天奇智新知識產(chǎn)權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

1.一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物，其特征在于：所述引物的序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:6所示，

SEQ?ID?NO:15’-AGTTCGCGTTTTTAGAACG-3’

SEQ?ID?NO:25’-AATCCAAAAACCCCAAACC-3’

SEQ?ID?NO:35’-TAGAATGTTTTGTGTTTTGATGTTTGTAG-3’

SEQ?ID?NO:45’-ACTCTTCCAAAAACAAAACAACCCAAACA-3’

SEQ?ID?NO:55’-CGTTTGCGTTTCGACGTTCGTAG-3’

SEQ?ID?NO:65’-CTTCCGAAAACGAAACGACCCA-3’。

2.一種用于檢測MGMT基因甲基化的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：1）如權利要求1所述的引物；2）甲基化處理試劑、PCR?MIX反應液、去離子水、空白對照；3）分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。

3.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述引物的濃度均為5～10pmol/μl。

4.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：甲基化處理試劑可從北京天漠科技開發(fā)有限公司購買得到，其包括：CT?Conversion?Reagent、M-Binding?Buffer、M-Wash?Buffer、M-Desulphonation?Buffer、M-Elution?Buffer、Zymo-Spin?IC^TMColumn和Collection?Tube。

5.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述PCR?MIX反應液包括Taq?DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq?DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400μM，所述MgCl2的濃度為3mM。

6.權利要求1所述引物的使用方法，包括以下步驟：

（1）使用常規(guī)方法提取待測樣本的基因組DNA；

（2）對DNA進行亞硫酸鹽處理；

（3）進行巢式PCR：第一次PCR擴增模板為經(jīng)亞硫酸鹽處理的DNA，使用的引物序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示；以第一次PCR擴增的產(chǎn)物為模板，分兩管進行第二次PCR擴增，A管使用的引物序列如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；B管使用的引物序列如SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示；

（4）按照DHPLC（變性高效液相色譜分析）常規(guī)操作方法，將巢式PCR產(chǎn)物進行上機檢測，判讀檢測結果。

7.按照權利要求1所述的引物在診斷MGMT基因甲基化中的應用。

8.按照權利要求2～5中任一所述的試劑盒在診斷MGMT基因甲基化中的應用。