[發明專利]用于檢測EGFR基因熱點突變的引物、試劑盒和檢測方法

無效

• 申請號: 201310537369.1
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103602734A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 梁超;熊凱;程宇;邢軍英;劉曉峰;侯然;朱立文;王緒華;方國偉;黃士昂;陳忠
• 申請（專利權）人: 北京海思特臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及基因突變檢測引物和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測EGFR基因熱點突變的引物、試劑盒和檢測方法。?

背景技術

表皮生長因子受體（epidermal?growth?factor?receptor，EGFR）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，屬于受體酪氨酸激酶（tyrosine?kinase，TK）erbB／HER家族的一個成員，EGFR的激活即磷酸化對調節腫瘤細胞的生長、侵襲、轉化、存活、血管生成及轉移具有重要意義，研究表明，EGFR在許多惡性腫瘤中過高表達。?

近年來，隨著醫學分子生物學的發展，分子靶向治療作為惡性腫瘤治療的新手段，正日益受到臨床工作者們的重視，因此，EGFR作為惡性腫瘤治療的分子靶標而受到普遍關注。目前已開發出了吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）等表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal?growth?factor?receptor?tyrosine?kinases?inhibitor，EGFR-TKI），然而在臨床中，有些患者對EGFR-TKI的治療并不敏感或對該類藥物產生耐藥，故對EGFR-TKI耐藥機制的探索成為國內外研究的熱點。?

研究表明，這些靶向藥物的敏感性及耐藥性與腫瘤細胞EGFR突變密切相關。目前，在約半數耐藥患者中發現了EGFR第20外顯子T790M（T790M，threonine?at?position790）突變；而EGFR第19號外顯子內缺失突變和第21外顯子L858R突變則使突變細胞對藥物親和力增高，作用時間延長，對EGFR-TKI的敏感性增高。因此，在一線治療的惡性腫瘤患者中檢測EGFR基因突變具有重要的臨床意義，是決定患者是否能夠應用EGFR-TKI治療的先決條件。?

目前檢測EGFR突變主要通過直接測序法，該方法需要取得腫瘤組織標本，通過石蠟組織DNA提取，再進行PCR擴增、測序，最后對測序數據進行分析。這個方法對石蠟包埋組織標本要求高，要求標本中腫瘤組織含量達20%以上，檢測敏感度低，檢測流程復雜繁瑣，對數據分析要求高，且目前無商用試劑盒，對實驗室的儀器配備要求也較高。?

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種用于檢測EGFR基因熱點突變的引物，本發明還公開了包括有該引物的試劑盒及其使用方法。?

本申請的發明人根據EGFR基因的第19號外顯子內缺失突變（EXON19缺失突變）、第20外顯子T790M突變（EXON20T790M）和第21外顯子L858R突變（EXON21L858R）設計并合成了特異性引物，以外周血為樣本提取基因組DNA，可以快速檢測EGFR基因中這三處熱點突變，檢測敏感度高，可更高效地篩查出適宜EGFR-TKI治療方案的惡性腫瘤患者。?

根據本發明的實施例，提供了一種用于檢測EGFR基因熱點突變的引物，所述引物序列如下：?

SEQ?ID?NO:1?5’-ATCCCAGAAGGTGAGAAAGATAAAATTC-3’?

SEQ?ID?NO:2?5’-CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’?

SEQ?ID?NO:3?5’-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’?

SEQ?ID?NO:4?5’-CGAAGCCACACTGACGTGC-3’?

SEQ?ID?NO:5?5’-CGAAGGGCATGAGCCGC-3’?

SEQ?ID?NO:6?5’-CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’?

SEQ?ID?NO:7?5’-CAGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’?

SEQ?ID?NO:8?5’-TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3’?

SEQ?ID?NO:9?5’-CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’。?

根據本發明的實施例，還提供了一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒，其主要包括：1）引物，所述引物序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:9所示，PCR?MIX反應液，針對不同突變進行酶切的限制性內切酶，BSA溶液，?酶切緩沖液，陰性對照品，陽性對照品，去離子水；2）分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。?

優選的，上述引物的濃度均為5～10μmol/L。?