[發明專利]從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法

有效

• 申請號: 201310536459.9
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103757093A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 彭軍;張欣;張賀;蒲金基;謝藝賢;漆艷香;喻群芳;謝培蘭
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于香蕉枯萎病菌檢測領域，尤其涉及一種從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法。

背景技術

香蕉為芭蕉科芭蕉屬植物，是熱帶亞熱帶地區重要的經濟作物和糧食作物。香蕉枯萎病是香蕉產業的毀滅性病害，嚴重制約著我國香蕉產業健康發展。

香蕉枯萎病病原菌為Fusarium?oxysporum?Schlevht.f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyd.&Hans.（Foc），曾用名Fusarium?cubense?E.F.Smith，屬于半知菌類，瘤座菌目，鐮孢菌屬，中文名稱為尖孢鐮孢菌古巴專化型。該菌分為3個小種（race）。在我國，主要為1號小種（race1,R1）和4號小種（race4，R4）。1號小種發生歷史悠久，主要侵染粉蕉等，可以通過改種Cavendish類香蕉來解決1號小種的危害。4號小種于1996年傳入我國，嚴重危害我國香蕉產業的安全。4號小種又細分為亞熱帶4號小種（Subtropicalrace4,ST4）和熱帶4號小種(Tropicalrace4,TR4)。

香蕉枯萎病的傳播分遠距離傳播和近距離傳播，遠距離以病原菌隨香蕉組培苗二級苗的調運為主，近距離傳播是病原菌在蕉園內隨土壤傳播蔓延。Foc是一種維管束病害，也是熱帶重要的土傳病害，Foc的厚垣孢子在土壤中可以存活很多年，一旦遇到寄主即可侵染發病。因此，在實際生產中迫切需要針對土壤的病原菌快速檢測技術，用來檢測組培苗二級苗土壤、新開辟蕉園土壤是否帶菌以及疑似病株的快速診斷。因此，建立一套香蕉枯萎病病原菌4號小種快速、穩定的檢測方法是我國香蕉安全生產的重要保證。

近年來，有報道證實基于PCR的方法已經成功用于Foc的檢測，PCR方法在操作時間上以及檢測的特異性和靈敏度方面較常規方法有較大提高，但是，PCR檢測技術需要特殊的儀器設備且檢測成本較高，而且它的檢測時間也還是比較長（2～3小時），不適合田間大規模的快速應用。此外，由于目前報道的PCR檢測方法主要應用與感染的香蕉植株，沒有針對土壤開發相關的快速診斷技術。因此，在加強香蕉苗木以及土壤病原菌的檢疫監測中，迫切需要開發一種靈敏度高、操作簡便、成本低廉且結果判斷迅速的檢測方法，在一定程度上可以取代PCR的檢測方法。

DNA環介導等溫擴增技術（loop-mediated?isothermal?amplification?of?DNA,LAMP）克服以往基因擴增方法的不足，在等溫條件下能夠特異性、高效、快速地進行核酸的擴增，具有很多的優越性（Notomi等，2000）。該方法通常是按如下步驟進行：步驟一、對被檢標本進行預處理，快速提取被檢標本的DNA；步驟二、特異性引物的制備：確定待測標本的靶基因后，取得特異性引物2對，內引物和外引物各一對；步驟三、進行環介導等溫擴增技術（LAMP）反應：將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63℃保溫1.5小時進行循環鏈置換反應；步驟四、分析判斷反應產物結果。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（real-time?fluorescence?loop-mediated?isothermal?amplification?assay，簡稱RealAmp）是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術，可以定量檢測病原物，具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩定等優點。此外，SYBR?GreenI是目前LAMP產物最靈敏的檢測方法之一，但是在RealAmp中SYBR?GreenI的加入可能會抑制LAMP的反應效率，因此，在實際操作中普遍采用SYTO-9熒光染料進行RealAmp反應，而把SYBRGreenI染色顏色判斷結果作為定量檢測的一種輔助判斷措施。

Linetal.(2009)通過隨機引物擴增RAPD獲得一個Focrace4特異性的OPA02₄₀₄RAPD分子標簽（GenBank登錄號EF155535.1），以此序列為基礎設計特異引物檢測Race4。并根據OPA02₄₀₄序列設計了Focrace4的PCR特異性引物Foc-1/Foc-2(5′-CAGGGGATGTATGAGGAGGCT-3′/5′-GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC-3′)，擴增片段大小為242bp，對香蕉組織進行快速檢測分析。