[發明專利]從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法

有效

• 申請號: 201310536459.9
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103757093A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 彭軍;張欣;張賀;蒲金基;謝藝賢;漆艷香;喻群芳;謝培蘭
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法，其特征在于，該從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法包括以下步驟：

步驟一、對被檢樣品進行預處理，提取被檢樣品的DNA；

步驟二、特異性引物的制備；

步驟三、熒光核酸恒溫擴增檢測技術RealAmp反應；

步驟四、RealAmp標準曲線的構建；

步驟五、結果判斷。

2.如權利要求1所述的從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法，其特征在于，步驟一被檢樣品DNA提取的步驟：

按照1克土對應2ml的比例加入SPCB緩沖液，100μg/ml蛋白酶K37℃處理30min-60min，然后終濃度為1%的SDS65℃度水浴1-2hr后，室溫離心取上清，等體積的氯仿抽提一次去除蛋白，若抽提后界面還不清晰，可以考慮氯仿抽提一次；離心后取上清，加入0.3M的NaAcPh5.2和等體積的異丙醇-20℃1hr沉淀DNA，離心后用75%乙醇清洗1-3次，加入100μl的ddH₂O；

SPCB緩沖液為100mmol/LTris-HCl，100mmol/LEDTA，120mMNa₃PO4，2%CTAB，1.5MNaCl，pH8.0，2%巰基乙醇；

純化步驟：G-50與PVPP混合制備純化柱子，也可采用Bio-rad的Micro?Bio-Spin，過柱后保存DNA備用；

柱子制備：0.8mlG-75slurry加入離心管約13-14mm，在上面加入干的PVPP約5-7mm，然后兩次加入100ul的水后350×g3min，最后在制備好的柱子中加入100μl的土壤DNA，350g離心1min，再次離心純化DNA。

3.如權利要求1所述的從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法，其特征在于，步驟二中特異性引物的制備具體方法如下：

1）根據FocSCAR特異性序列GenBank登錄號EF155535.1設計出2對特異性引物，包含內側引物F3和B3和外側引物FIP和BIP各一對；

2）由兩對引物構成的引物混合液，其中F3即5′-CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3′和B3即5′-TGTTCTGCCAGTTTGACG-3′為外側引物，FIP即5′-GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3′和BIP即5′-CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3′為內側引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的濃度分別為5pmol/μl；所述內引物FocTR4-FIP和所述內引物FocTR4-BIP的濃度均為40pmol/μl。

4.如權利要求1所述的從土壤中定量檢測香蕉枯萎病菌4號小種的方法，其特征在于，步驟三熒光核酸恒溫擴增檢測技術RealAmp反應具體方法為：

將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63℃保溫90min進行循環鏈置換反應；

RealAmp25μL反應體系：1μL抽提的核酸DNA作為模板，2.5μL10×BstDNApolymersebuffer、1.4mMdNTPs、0.8mM甜菜堿、8mMMgSO4、0.2μM的外引物B3和F3、1.6μM的內引物FIP和BIP、1μLBstDNApolymerase8U/μL，0.2μMSYTO-9熒光染料，補水至25μL，然后再加入等體系的石蠟油覆蓋整個反應液防止揮發；

RealAmp反應在ESE-QuantTubeScanner上進行，63℃反應90min后80℃反應10min終止反應；

RealAmp反應前在反應管內蓋上加如1μL1:10倍稀釋的SYBR?GreenI熒光染料，待反應結束后離心將SYBRGreenI加入LAMP反應液中進行顯色觀察；

設置陽性對照反應時，用感染FOC的柑橘基因組總DNA代替；設置陰性對照反應時，用TE即100mMTris-HClpH8.0與50mM?EDTA代替，將含有配制好的反應溶液的反應管置于63℃反應90min；反應結束后顯示屏上顯示擴增曲線。