[發明專利]一種稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法

無效

• 申請號: 201310533956.3
• 申請日: 2013-11-01
• 公開（公告）號: CN103592161A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 周曉罡;余萍;姚春馨;董超;丁玉梅;陶南
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將稻瘟病菌菌株由試管轉接到固體培養基上，所述固體培養基為葡萄糖15.0g.L^-1，酵母粉5.0g.L^-1，瓊脂粉12.0g.L^-1，H₂O1.0L，28℃暗培養7d，菌落直徑長達4-6cm時，切取大小為0.5cm×0.5cm的菌絲3-5塊，轉接到50mL稻瘟病菌全營養液體培養基上，其成分為NaNO₃6g，KCl0.52g，MgSO₄.7H₂O0.52g，KH₂PO₄1.52g，葡萄糖10g，微量元素2mL，蛋白胨2g，酵母粉1g，酪蛋白氨基酸1g，H₂O1.0L，上述微量元素的配方為ZnSO₄.7H₂O2.20g，H₃BO₃10.00g，MnCl₂.4H₂O0.50g，FeSO₄.7H₂O0.50g，CoCl₂.6H₂O0.16g，CuSO₄.5H₂O0.16g，(NH₄)₆MoO₂₄-4H₂O0.11g，Na₂-EDTA5g，用超純水定容至1000mL，28℃下150r.min^-1搖床振蕩培養3d，菌絲經雙層紗布過濾后用無菌水清洗除去培養基；

2)稱取5g的濕菌絲轉接到新配制的含KCl0.52g，MgSO₄.7H₂O0.52g，KH₂PO₄1.52g，葡萄糖10g，步驟1)所述微量元素2mL，H₂O1.0L的氮饑餓液體培養基或者全營養液體培養基，28℃下150r.min^-1搖床振蕩培養48h，將培養物用紗布進行過濾，菌絲經雙層紗布過濾后用無菌水清洗除去培養基，干凈的菌絲用抽濾瓶將水分抽干，將干燥后菌絲置于-80℃冰箱中保存備用；

3)稱取1g的菌絲體，用研缽在液氮中研磨后將其懸浮于30ml含0.1％DTT、1％PMSF和10％TCA的丙酮溶液中，-20℃過夜，低溫高速離心收集沉淀，向沉淀中加入30ml含0.1％DTT的80％丙酮水溶液，清洗沉淀，-20℃靜置2h，4℃下15000r.min^-1離心20min，棄上清，重復3次，真空干燥蛋白沉淀30min，至丙酮完全揮發；

4)將步驟3)中制得的蛋白沉淀加入1ml樣品水化液，室溫下充分溶解，離心取上清液，向此上清液中加入4倍體積預冷的含0.1％DTT的丙酮溶液，混勻，-20℃靜置2h，4℃下15000r.min^-1離心20min，收集沉淀；

5)將步驟4)中制得的蛋白沉淀加入300ul樣品水化液，室溫下充分溶解，離心取上清液，此上清液即為氮脅迫條件下稻瘟病菌菌絲體蛋白雙向電泳樣品，所述水化液組成為樣品水化液為7mol.L^-1尿素、2mol.L^-1硫脲、4％CHAPS、65mmol.L^-1DTT、0.3％IPGbuffer；

6)蛋白質定量：采用Bradford法測定其蛋白濃度；

7)第一向等點聚焦電泳：按上樣量500ug，上樣體積500ul，對已定量好的蛋白樣品進行稀釋，采用pH4-7，24cm?IPG膠條，被動水化，室溫泡漲法對IPG膠條進行泡漲，室溫下水平靜置13h后將膠條取出，將膠條放入聚焦盤進行等點聚焦；

8)膠條平衡：將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進行平衡I、II，每次平衡時間為20min，平衡緩沖液配制如下：

膠條平衡緩沖液母液：尿素6M，50mmol／L的1.5M?pH8.8的Tris-HCl，30％甘油，2％SDS，溶劑為水；

膠條平衡緩沖液I：每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0.1gDTT；

膠條平衡緩沖液II：每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0.25g碘乙酰胺；

9)第二向SDS-PAGE電泳：將平衡好的IPG膠條轉移至濃度為12.5％的分離膠的界面上，加入含0.001％溴酚藍的1％瓊脂糖封頂，16℃恒溫下，恒電流電泳，10mA／膠電泳2h后，改用30mA／膠電泳至結束；

10)采用考馬斯亮藍法對凝膠進行染色。

2.根據權利要求1所述的稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法，其特征在于，步驟7)中所述的等電聚焦參數設置如下：Step，250v，0.5h；Gradient，1000v，0.5h；Gradient，8000v，4h；Step，8000v，70000vh。