[發明專利]一種稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法

無效

• 申請號: 201310533956.3
• 申請日: 2013-11-01
• 公開（公告）號: CN103592161A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 周曉罡;余萍;姚春馨;董超;丁玉梅;陶南
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法，具體地說，涉及一種氮脅迫條件下稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法。

背景技術

稻瘟病是由稻瘟病菌引起，對水稻造成為害最為嚴重的病害，每年造成全球水稻產量損失超過1億噸。在其與水稻的相互作用中，稻瘟病菌菌絲分化形成的附著孢和侵染菌絲及其分泌蛋白質等是其對水稻產生病害的主要因素。氮饑餓脅迫是稻瘟病菌在寄主植物組織內面對的主要環境壓力和產生致病蛋白質的重要原因。研究氮饑餓脅迫對稻瘟病菌菌絲體蛋白質組的影響對于了解其致病機制具有重要意義。稻瘟病菌也是研究植物與病原微生物相互作用的重要模式生物。

蛋白質組是由Marc?Wilkins于1995年首次提出的，是指在特定的時間和空間上一個細胞或一個組織基因組所表達的全部相應蛋白質。雙向電泳是目前蛋白質組學重要的實驗方法。近年來，利用雙向電泳已在微生物發育、生物和非生物脅迫響應等方面的蛋白質組學進行了廣泛研究，對闡述其分子機制發揮了重要作用。

蛋白質樣品的制備是雙向電泳技術成功與否的關鍵。真菌細胞中含有多糖及脂類等非蛋白質雜質，會干擾雙向電泳的進行及其分離效果。盡可能多地保留樣品中蛋白質的同時必須有效去除其中的雜質才能獲得高質量電泳圖譜。TCA／丙酮法沉淀蛋白質是真菌菌絲體蛋白提取的常用方法，在植物蛋白質提取中也有著廣泛的應用。在雙向電泳蛋白質樣品制備中，用水化液溶解TCA／丙酮沉淀的蛋白質后再用TCA或者丙酮進行沉淀，是消除樣品中雜質對電泳影響的有效方法。目前關于稻瘟病菌菌絲體蛋白質組的研究尚未見報道。本試驗在已有的方法基礎上，針對稻瘟病菌菌絲體進行優化，以建立適宜的雙向電泳技術體系，為開展稻瘟病菌菌絲體蛋白質組學研究奠定基礎。

發明內容

為了克服現有技術中的缺陷，本發明提供了一種稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法，其技術方案為，

一種稻瘟病菌菌絲體全蛋白雙向電泳樣品的制備方法，包括以下步驟：

1)將稻瘟病菌菌株由試管轉接到固體培養基上，所述固體培養基為葡萄糖15.0g.L^-1，酵母粉5.0g.L^-1，瓊脂粉12.0g.L^-1，H₂O1.0L，28℃暗培養7d，菌落直徑長達4-6cm時，切取大小為0.5cm×0.5cm的菌絲3-5塊，轉接到50mL稻瘟病菌全營養液體培養基上，其成分為NaNO₃6g，KCl0.52g，MgSO₄.7H₂O0.52g，KH₂PO₄1.52g，葡萄糖10g，微量元素2mL，蛋白胨2g，酵母粉1g，酪蛋白氨基酸1g，H₂O1.0L，上述微量元素的配方為ZnSO₄.7H₂O2.20g，H₃BO₃10.00g，MnCl₂.4H₂O0.50g，FeSO₄.7H₂O0.50g，CoCl₂.6H₂O0.16g，CuSO₄.5H₂O0.16g，(NH₄)₆MoO₂₄-4H₂O0.11g，Na₂-EDTA5g，用超純水定容至1000mL，28℃下150r.min^-1搖床振蕩培養3d，菌絲經雙層紗布過濾后用無菌水清洗除去培養基。

2)稱取5g的濕菌絲轉接到新配制的含KCl0.52g，MgSO₄.7H₂O0.52g，KH₂PO₄1.52g，葡萄糖10g，微量元素2mL(同上)，H₂O1.0L的氮饑餓液體培養基或者全營養液體培養基，28℃下150r.min^-1搖床振蕩培養48h，將培養物用紗布進行過濾，菌絲經雙層紗布過濾后用無菌水清洗除去培養基，干凈的菌絲用抽濾瓶將水分抽干，將干燥后菌絲置于-80℃冰箱中保存備用；