[發明專利]一種用于細胞培養基的玉米活性肽添加劑

有效

• 申請號: 201310533664.X
• 申請日: 2013-10-31
• 公開（公告）號: CN104593318B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 蔡木易;林峰;劉艷;張海欣;谷瑞增;魯軍;魏穎
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司11205
• 代理人: 王慶龍

1.一種用于細胞培養基的玉米活性肽添加劑，其特征在于，所述玉米活性肽添加劑中分子量小于1000道爾頓的低聚肽占總蛋白的質量百分比≥90％，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、TQPGPQ；

所述玉米活性肽添加劑是通過依次采用非特異性蛋白酶和特異性蛋白酶對玉米黃粉進行酶解后，經分離純化制得的；

所述非特異性蛋白酶選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或多種，所述特異性蛋白酶選自羧肽酶、風味蛋白酶中的一種或兩種；所述非特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000～6000單位，其中包括0～1000單位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000單位酶量的堿性蛋白酶、500～2000單位酶量的中性蛋白酶和0～1500單位酶量的菠蘿蛋白酶中的至少兩種；所述特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000～3000單位，其中包括500～2000單位酶量的羧肽酶和1000～2000單位酶量的風味蛋白酶中的一種或兩種；

所述玉米活性肽添加劑中內毒素的含量<200EU/g；

所述玉米活性肽添加劑的制備方法，包括如下步驟：

1)首先采用非特異性蛋白酶對玉米黃粉進行第一酶解處理，制得第一酶解液；然后采用特異性蛋白酶對所述第一酶解液進行第二酶解處理，制得玉米蛋白酶解液；所述非特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000～6000單位，其中包括0～1000單位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000單位酶量的堿性蛋白酶、500～2000單位酶量的中性蛋白酶和0～1500單位酶量的菠蘿蛋白酶中的至少兩種；所述特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000～3000單位，其中包括500～2000單位酶量的羧肽酶和1000～2000單位酶量的風味蛋白酶中的一種或兩種；

2)將所述玉米蛋白酶解液進行離心，依次對離心上清液進行微濾、陽離子交換、納濾和超濾，制得玉米活性肽；其中所述微濾采用孔徑為50～500nm的濾膜進行，所述納濾采用截留分子量為100～300道爾頓的濾膜進行，所述超濾采用截留分子量為5000～13000道爾頓的濾膜進行；

步驟1)具體包括：將玉米黃粉與水混合制成蛋白溶液后，以每克蛋白2000～6000單位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特異性蛋白酶，于40～60℃第一酶解處理1.5～4.5小時，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000～3000單位的酶量向所述第一酶解液中加入所述特異性蛋白酶，于40～60℃第二酶解處理2～3小時后，滅酶，制得玉米蛋白酶解液；

步驟2)中所述微濾具體包括：先采用孔徑為200～500nm的濾膜對所述離心上清液進行第一微濾，制得第一微濾液，然后采用孔徑為50～200nm的濾膜對所述第一微濾液進行第二微濾，制得第二微濾液；

步驟2)中所述納濾具體包括：采用截留分子量為100～300道爾頓的卷式膜將經所述陽離子交換后的離心上清液濃縮至蛋白質含量為5～10％后進行洗濾，使經洗濾后的離心上清液中無機鹽的含量≤5％；再將經洗濾后的離心上清液濃縮至蛋白質含量為20～40％。

2.根據權利要求1所述的玉米活性肽添加劑，其特征在于，所述低聚肽還包括AY、NAP、PVIN、AYPQ中的一種或多種。

3.權利要求1至2任一所述的玉米活性肽添加劑在細胞無血清培養上的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述細胞包括CHO細胞、Vero細胞、HEK-293細胞、BHK-21細胞、MARC-145細胞、雜交瘤細胞、MDCK細胞中的一種或多種。

5.權利要求1至2任一所述的玉米活性肽添加劑在促進細胞增殖、提高細胞活力和/或增強細胞產物表達上的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述細胞包括CHO細胞、Vero細胞、HEK-293細胞、BHK-21細胞、MARC-145細胞、雜交瘤細胞、MDCK細胞中的一種或多種。

7.一種無血清培養基，其特征在于，包括權利要求1至2任一所述的玉米活性肽添加劑，所述玉米活性肽添加劑在所述無血清培養基中的濃度為0.01～20g/L。