[發明專利]一種用于細胞培養基的玉米活性肽添加劑

有效

• 申請號: 201310533664.X
• 申請日: 2013-10-31
• 公開（公告）號: CN104593318B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 蔡木易;林峰;劉艷;張海欣;谷瑞增;魯軍;魏穎
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司11205
• 代理人: 王慶龍

技術領域

本發明涉及一種細胞培養基添加劑，特別是涉及一種用于細胞培養基的玉米活性肽添加劑。

背景技術

培養基是決定體外培養細胞生長代謝的最直接、最重要的環境因素。動物細胞培養基通常含有血清等動物源添加物，而隨著全球瘋牛病的流行爆發，血清等動物來源添加物的使用，給生物制藥工業帶來感染性海綿狀腦病（TSEs）病毒及其它危險物質的安全性風險驟然上升。全世界的藥品監管機構要求藥物生產商在制藥生產中減少牛源成分的使用，相關立法機關也越來越反對在制藥領域使用牛血清等動物源成分。美國食品及藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）嚴格控制在商業化生產培養基過程中使用動物源成分，以保證病人最終的服藥安全。同時，血清及其他動物源的培養基添加物中含有生長因子、轉運蛋白、貼壁因子、激素等大分子蛋白質，為抗體藥物、疫苗等生物制品后期分離純化帶來壓力，最終影響產品得率，增加生產成本。因此，非動物源細胞培養添加物的開發及應用符合當前的發展方向，目前已成為動物細胞體外培養及生物制藥領域的重要課題。

玉米黃粉是玉米經濕磨法工藝制得粗淀粉乳，再經蛋白質分離得到麩質水，然后濃縮干燥制得的，其是玉米濕法加工淀粉時的主要副產物，含有60%以上的蛋白質，還含有無機鹽和多種維生素。玉米活性肽是以玉米黃粉為原料，經預處理、生物酶水解、多級分離提純、濃縮干燥等工藝制備出的小分子肽類混合物，其是天然玉米蛋白資源生物加工和轉化利用領域的尖端產品。玉米活性肽來源于植物蛋白，避免了血清等動物性成分中潛在的病毒微生物污染等問題；其批次間質量一致，有利于提高細胞產品生產的穩定性；其不含大分子蛋白，有益于細胞產品下游分離純化。

玉米活性肽營養物質豐富，在其加工及儲藏過程中易受細菌微生物污染，進而產生大量細菌內毒素，將其作為細胞培養添加劑使用時會改變細胞形態、破壞細胞膜結構、誘導細胞凋亡等，對體外培養的細胞生長產生不利影響。除此之外，由于不同的加工工藝對制備的玉米活性肽產品的組成具有較大影響，而動物血清成分較為復雜，很多成分至今尚不清楚，因此無法確定某種或某些成分的存在或者缺失是否會對細胞的生長產生不良影響，從而給玉米活性肽在無血清培養基添加劑上的應用造成一定的困難。

發明內容

本發明提供了一種玉米活性肽添加劑及其應用，該玉米活性肽內毒素含量低，在作為細胞培養基添加劑應用時，可與多種基礎培養基進行復配，用于對多種細胞系進行無血清培養，并且還能促進細胞增殖，提高細胞活力以及增強細胞產物表達。

本發明還提供一種用于細胞培養基的玉米活性肽的制備方法，其操作簡便，酶解效率高，并且可將小分子的活性肽與大分子蛋白、細菌內毒素及小分子鹽類進行高效地分離，適合大規模工業化生產。

本發明提供的一種用于細胞培養基的玉米活性肽添加劑，其中分子量小于1000道爾頓的低聚肽占總蛋白的質量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、TQPGPQ中的一種或多種。

進一步地，所述低聚肽還包括AY、NAP、PVIN、AYPQ中的一種或多種。

進一步地，所述玉米活性肽添加劑中內毒素的含量<200EU/g，特別是內毒素含量<50EU/g。

根據本發明提供的玉米活性肽添加劑，其是通過依次采用非特異性蛋白酶和特異性蛋白酶對玉米黃粉進行酶解后，經分離純化制得的。

本發明所述的非特異性蛋白酶指的是對所作用的底物的特異性低、具有較寬的底物特異性的一類蛋白酶，如堿性蛋白酶，其可水解多種蛋白質分子的肽鏈生成多肽或氨基酸；又如菠蘿蛋白酶，其能分解多種蛋白質以及肽、脂和酰胺等。本發明所述的特異性蛋白酶指的是底物特異性相對嚴格、僅能作用于蛋白質分子中某些特定肽鍵的一類蛋白酶，如羧肽酶催化水解含羧基的末端氨基酸所形成的肽鍵等。

在本發明具體方案中，所述非特異性蛋白酶選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或多種，所述特異性蛋白酶選自羧肽酶、風味蛋白酶中的一種或兩種；特別是，所述非特異性蛋白酶選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的兩種或兩種以上。本發明先采用特異性蛋白酶對玉米黃粉進行酶解，然后采用非特異性蛋白酶對酶解產物進一步進行酶解，兩者配合使用能夠達到較高的酶解效率，并且酶解液中的活性肽、特別是小分子量的活性肽的含量高。