[發(fā)明專利]一種棗樹抗病基因轉(zhuǎn)化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310532582.3
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103525863B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃艷艷;羅磊;馮殿齊;劉靜;趙進紅;張虹;王玉山
• 申請（專利權(quán)）人: 泰安市泰山林業(yè)科學研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種棗樹抗病基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：所述方法具體步驟如下：

(1)預培養(yǎng)受體材料：選擇大棗組培苗進行取材，組培苗應(yīng)生長健壯，無玻璃化及枯黃現(xiàn)象，高度1～3cm，貼近培養(yǎng)基的莖基部粗度目測高于1mm，每段莖段長度為1～1.5cm，至少保留一個芽，將剪取的莖段淺嵌于分化培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基厚度1～2cm，每瓶培養(yǎng)基體積約15～20ml，每瓶培養(yǎng)基可放6～8個莖段；將嵌入培養(yǎng)基的莖段置于黑暗環(huán)境下暗培養(yǎng)2～6d，培養(yǎng)溫度25℃左右；

(2)制備侵染液：包括：①農(nóng)桿菌菌液制備：挑取農(nóng)桿菌菌株LBA4404(由中科院遺傳所提供)的單菌落接種到5ml含有50mg／L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃，震蕩轉(zhuǎn)速160～200rpm條件下培養(yǎng)12～48h，然后取1～5ml轉(zhuǎn)接于100ml含有50mg／L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃、轉(zhuǎn)速160～200rpm的條件下培養(yǎng)12～24h，菌液OD6000.3～0.7時作為備用菌液；②MS母液的制備：本發(fā)明所用MS母液為MS培養(yǎng)基常用量的全量MS母液，按每升培養(yǎng)基常規(guī)用量配制，為包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物四類溶液的混合液，母液混勻后高壓滅菌備用；

(3)侵染受體材料：先將制備好的農(nóng)桿菌菌液和MS母液按1／3～1／2體積比混合，將混合液倒入空的無菌培養(yǎng)瓶并調(diào)節(jié)pH6.2～6.7，備用；再將已預培養(yǎng)的受體材料莖段取出，置于無菌空培養(yǎng)皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，再在無菌條件下進行適當刻傷，對照材料同時進行同樣刻傷處理；刻傷處理后，將受體材料轉(zhuǎn)移至已盛有侵染液的培養(yǎng)瓶內(nèi)侵染15～20min，侵染液體積以沒過侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動侵染瓶，以使材料與侵染液充分接觸；

(4)共培養(yǎng)：侵染結(jié)束，取出受體莖段，用無菌濾紙吸干表面多余液體，轉(zhuǎn)接于表面加蓋一層用MS母液潤濕的無菌濾紙的雙層培養(yǎng)基上，仍按每瓶培養(yǎng)基6～8個莖段放置；將封好口的培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下共培養(yǎng)2～4d，培養(yǎng)溫度23～28℃左右；對照組同樣處理；

(5)抑菌及卡那霉素篩選培養(yǎng)：共培養(yǎng)結(jié)束，將受體材料轉(zhuǎn)接于含有卡那霉素(kanamycin)和抑菌素Cef(頭孢霉素)的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，分3個階段進行，各階段的培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)為pH6.2～7.0；第一階段卡那霉素20mg／L，抑菌素Cef(頭孢霉素)400mg／L，培養(yǎng)6～10d；第二階段卡那霉素40mg／L，抑菌素Cef(頭孢霉素)400mg／L，培養(yǎng)15～20d；第三階段卡那霉素60mg／L，抑菌素Cef(頭孢霉素)200mg／L，培養(yǎng)20～30d；

(6)分子檢測：經(jīng)過上述兩個階段的Cef抑菌和卡那霉素篩選培養(yǎng)，20d后，受體莖段表現(xiàn)出明顯分離生長狀態(tài)，超過1／3的莖段出現(xiàn)由黃化至枯死的變化，約2／3莖段萌發(fā)出綠色的抗性新芽，抗性芽長度大約0.5～1cm；對存活的抗性芽苗進行采樣，提取抗性芽的DNA并進行PCR擴增檢測，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的方法是CTAB法，采用CcRIP?II～2基因序列資料，設(shè)計引物：

引物1：5’～TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT～3’；

引物2：5’～TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA～3’。