[發(fā)明專利]一種棗樹抗病基因轉化的方法

有效

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• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103525863B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發(fā)明（設計）人: 黃艷艷;羅磊;馮殿齊;劉靜;趙進紅;張虹;王玉山
• 申請（專利權）人: 泰安市泰山林業(yè)科學研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68;A01H5/00
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技術領域

本發(fā)明涉及一種棗樹抗病基因轉化的方法，屬于植物生物技術領域。

背景技術

自古以來，棗因具有很高的營養(yǎng)保健和藥用價值，受到人們廣泛歡迎，這也使棗產業(yè)成為一些地方經濟支柱產業(yè)之一，但棗瘋病的蔓延卻嚴重制約了棗產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，影響了人們對棗果的旺盛需求，限制了棗產區(qū)的經濟發(fā)展步伐。

1983年來，植物基因工程發(fā)展很快，但是在果樹上應用的研究還很少，由于果樹育種周期長，不斷地摸索試驗快速有效的育種方法是很有意義的。對于棗瘋病的防治，多采用化學防治和物理防治等方法，但效果都難以持久。因此，利用基因工程技術，尋找一種以棗樹本身為基礎，從根本上解決問題的方法，提高棗樹自身抵抗棗瘋病病毒的能力，成為解決此問題的一種有效途徑。

本項技術發(fā)明采用的農桿菌介導的轉化方法是目前應用最廣的基因轉化方法，具有操作簡便、成本低、轉化率高的特點，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化。但其也具有一定局限性，即基因介導的效率易受到很多因素的影響，如受體材料的部位、年齡、生長狀態(tài)等，這就需要尋找最適合的搭配組合，最大限度地提高轉化效率。

在實際操作中，農桿菌介導法要求先建立較完善的植物受體系統(tǒng)，一般采用的植物受體材料是葉盤或愈傷組織，這樣可以大大提高轉化效率，但對于很多難于建立高效再生體系的木本植物的基因轉化就有了很大限制。在棗樹等木本植物基因轉化試驗中還存在基因轉化困難，效率低、周期長、轉化后嵌合體現象嚴重等問題，因此，如何解決棗樹等木本植物基因轉化困難并進一步提高基因轉化效率成為當前一個亟需解決的問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服上述技術的缺陷，提供一種以棗樹組培苗莖段為受體材料，以pH6.2～7.0的MS母液與農桿菌菌液的混合液為侵染液，受體轉化后共培養(yǎng)采用雙層培養(yǎng)基，抗生素篩選分3個階段進行的基因轉化方法，以解決木本植物棗樹基因轉化困難的問題。

為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種棗樹抗病基因轉化的方法，具體步驟如下：

(1)預培養(yǎng)受體材料：選擇大棗組培苗進行取材，組培苗應生長健壯，無玻璃化及枯黃現象，高度1～3cm，貼近培養(yǎng)基的莖基部粗度目測高于1mm，每段莖段長度為1～1.5cm，至少保留一個芽，將剪取的莖段淺嵌于分化培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基厚度1～2cm，每瓶培養(yǎng)基體積約15～20ml，每瓶培養(yǎng)基可放6～8個莖段；將嵌入培養(yǎng)基的莖段置于黑暗環(huán)境下暗培養(yǎng)2～6d，培養(yǎng)溫度25℃左右。

(2)制備侵染液：包括：①農桿菌菌液制備：挑取農桿菌菌株LBA4404(由中科院遺傳所提供)的單菌落接種到5ml含有50mg／L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃，震蕩轉速160～200rpm條件下培養(yǎng)12～48h，然后取1～5ml轉接于100ml含有50mg／L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃、轉速160～200rpm的條件下培養(yǎng)12～24h，菌液OD6000.3～0.7時作為備用菌液；②MS母液的制備：本發(fā)明所用MS母液為MS培養(yǎng)基常用量的全量MS母液，按每升培養(yǎng)基常規(guī)用量配制，為包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物四類溶液的混合液，母液混勻后高壓滅菌備用。

(3)侵染受體材料：先將制備好的農桿菌菌液和MS母液按1／3～1／2體積比混合，將混合液倒入空的無菌培養(yǎng)瓶并調節(jié)pH6.2～6.7，備用；再將已預培養(yǎng)的受體材料莖段取出，置于無菌空培養(yǎng)皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，再在無菌條件下進行適當刻傷，對照材料同時進行同樣刻傷處理。刻傷處理后，將受體材料轉移至已盛有侵染液的培養(yǎng)瓶內侵染15～20min，侵染液體積以沒過侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動侵染瓶，以使材料與侵染液充分接觸。

(4)共培養(yǎng)：侵染結束，取出受體莖段，用無菌濾紙吸干表面多余液體，轉接于表面加蓋一層用MS母液潤濕的無菌濾紙的雙層培養(yǎng)基上，仍按每瓶培養(yǎng)基6～8個莖段放置。將封好口的培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下共培養(yǎng)2～4d，培養(yǎng)溫度23～28℃左右。對照同樣處理。