[發(fā)明專利]基于表位抗原肽的抗mtDNA抗體酶聯(lián)免疫的檢測方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310531096.X
• 申請(qǐng)日: 2013-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN104597244A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳莊民;陳曉翔;葉霜;張瑱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吳莊民
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/564
• 代理公司: 上海和躍知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31239
• 代理人: 杜林雪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于臨床自身抗體檢測領(lǐng)域，具體涉及基于mtDNA為抗原的抗體mtDNA抗體酶聯(lián)免疫檢測方法及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的診斷應(yīng)用。

背景技術(shù)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是自身免疫介導(dǎo)的,以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，血清中出現(xiàn)多種結(jié)合DNA/RNA的自身抗體和多系統(tǒng)受累為特征。研究顯示細(xì)胞死亡后釋放的DNA核蛋白質(zhì)復(fù)合物增多或其清除障礙可能啟動(dòng)抗體產(chǎn)生而發(fā)病。已有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者存在線粒體功能障礙，Peter?Gergely?Jr等發(fā)現(xiàn)狼瘡病人外周血淋巴細(xì)胞的線粒體跨膜電位和線粒體活性氧產(chǎn)物均較正常對(duì)照組和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組升高，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，ATP生成減少、細(xì)胞死亡和炎癥發(fā)生。2004年，Brinkmann,V.等人定義了一種新的中性粒細(xì)胞死亡方式“NETosis”，不同于壞死和凋亡，NET樣凋亡以釋放免疫原性自身DNA-抗菌肽復(fù)合物為特點(diǎn)。之所以稱之為“NETs”，是因?yàn)樵谶@種死亡方式中，活化的中性粒細(xì)胞向胞外，釋放出大量絲網(wǎng)狀無定型的DNA。與正常人相比，SLE患者的中性粒細(xì)胞凋亡加速且清除障礙。NETs與SLE活動(dòng)、狼瘡腎炎和低補(bǔ)體等都有相關(guān)性。NETs本身作為自身抗原，誘導(dǎo)SLE患者產(chǎn)生自身抗體，加重組織器官損傷。NET中的DNA既包含核DNA也包含線粒體DNA，它們均具有潛在的致炎性。而在中性粒細(xì)胞激活的早期，細(xì)胞未死亡時(shí)，僅線粒體DNA通過NET以ROS依賴的方式，被主動(dòng)釋放入胞外；晚期，細(xì)胞陸續(xù)死亡，NET中可同時(shí)檢測到核DNA和線粒體DNA。

抗雙鏈DNA抗體(抗ds－DNA抗體)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的標(biāo)記性抗體之一，目前認(rèn)為抗ds－DNA抗體除幫助診斷SLE外，尚可判斷SLE的活動(dòng)性及作為評(píng)估療效的標(biāo)記。已證明抗ds－DNA抗體與DNA結(jié)合成為免疫復(fù)合物，在腎小球基底膜或多種器官微血管沉積，或抗ds－DNA抗體直接作用于腎小球抗原或結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞表面的NMDAR2導(dǎo)致神經(jīng)精神癥狀,此外該抗體還可以激活補(bǔ)體，而造成SLE患者的損害。但也有一些研究認(rèn)為抗ds-DNA抗體與臨床表現(xiàn)并不一致。

我們的研究發(fā)現(xiàn)我們檢測了狼瘡患者和正常人血漿中的抗mtDNA抗體和抗dsDNA抗體。我們發(fā)現(xiàn)抗mtDNA抗體滴度在SLE患者中明顯增高（圖1A），而且抗mtDNA抗體高的患者往往也具有高低度的抗dsDNA抗體（圖1B)。抗mtDNA抗體可以顯著誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）釋放干擾素α，我們對(duì)其中留取血樣的病人進(jìn)行了SLEDAI評(píng)分，以及干擾素誘導(dǎo)基因積分的計(jì)算。干擾素積分已被證實(shí)可以從一定程度上反應(yīng)狼瘡疾病的活動(dòng)。通過相關(guān)性分析我們發(fā)現(xiàn)，SLE患者NET中mtDNA的含量與患者SLEDAI評(píng)分（圖2A）和外周血單個(gè)核細(xì)胞干擾素積分（圖2B）正相關(guān)。因此，抗mtDNA抗體是SLE的標(biāo)記抗體，而且是一種致病性抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種基于表位抗原肽的抗mtDNA抗體酶聯(lián)免疫的檢測方法，介于抗mtDNA抗體的致病性，其可替代抗ds-DNA抗體的檢測，成為SLE的生物標(biāo)記之一。

本發(fā)明的目的之二在于提供這種抗mtDNA抗體酶聯(lián)免疫檢測方法在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的診斷應(yīng)用，用于判定SLE疾病危重度和轉(zhuǎn)歸。

本發(fā)明目的之三是提供抗mtDNA抗體的試劑和試劑盒。

本發(fā)明的發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

在前期首先在SLE患者血清中檢測了抗mtDNA抗體

基于表位抗原肽的抗mtDNA抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，具體步驟如下：

1）應(yīng)用線粒體分離試劑盒（Thermo）抽提哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞線粒體；

2）應(yīng)用DNA抽提試劑盒（Qiagen）提取線粒體DNA（mtDNA）；

3）DNA凝膠電泳檢測mtDNA完整性（約16,500bp）。NanoDrop^TM1000分光光度儀檢測mtDNA濃度（pg/ml）及質(zhì)量（OD260/280>1.8）；

4）用DNA包被液（Pierce）將mtDNA包被于ELISA板上（Nunc），包被濃度5μg/ml，100μL每孔，4℃過夜；

5）4℃取出包被板，PBS洗板4次，1%明膠室溫封閉1h；

6）清空封閉液，PBS洗板4次，加入待測血清（1:100稀釋），室溫孵育1—2h；

7）清空待測血清，PBS洗板4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG二抗（歐盟），室溫孵育1h；