[發(fā)明專(zhuān)利]一種長(zhǎng)效重組促卵泡激素及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310529898.7
• 申請(qǐng)日: 2013-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103539862A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯永敏;吳茂柏;李屹晨;雷瑤;徐楨琦
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州優(yōu)聯(lián)康醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C07K1/22;C07K1/20;C12N15/62;C12N15/85;A61K38/24;A61K47/48;A61P15/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和獸藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效重組人促卵泡激素融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用。該融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長(zhǎng)，其在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域中的療效優(yōu)于現(xiàn)有促卵泡激素產(chǎn)品。

背景技術(shù)

促卵泡素(Follicle-stimulating?hormone，簡(jiǎn)稱(chēng)FSH)是動(dòng)物繁殖領(lǐng)域常用的藥物主要成分，現(xiàn)有上市FSH主要為豬垂體中提取的生化品種，可用于青年母豬提前發(fā)情和同期發(fā)情、及超期不發(fā)情母豬促發(fā)情，在牛和羊繁殖領(lǐng)域也有更廣泛的應(yīng)用。生化提取的FSH存在病毒污染、原料來(lái)源有限、采集困難、含量低及純化過(guò)程復(fù)雜等缺陷。另外，因檢測(cè)方法及病毒滅活技術(shù)的局限性以及一些不可預(yù)知的新致病病毒感染時(shí)有發(fā)生，并不能完全杜絕生化提取產(chǎn)品發(fā)生病毒污染的可能性。

相比而言，重組FSH在其純度、抗原性、安全性、無(wú)病毒感染等方面具有生化FSH產(chǎn)品無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，還未有重組FSH產(chǎn)品用于獸藥領(lǐng)域。FSH是一種糖基化蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其分子量為43KD。另外，hFSH是具有兩條單鏈(α鏈和β鏈)的糖基化蛋白，鏈間以非共價(jià)鍵連接，兩條鏈的正確折疊才能保證hFSH的生物活性。如何在蛋白表達(dá)和純化過(guò)程中保持兩條鏈的正常結(jié)合是一個(gè)挑戰(zhàn)。作為一種治療藥物，保證其生物活性，必要的條件是具有正確的三維結(jié)構(gòu)和糖基化修飾。具有完善翻譯后修飾功能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞被選作大多數(shù)生物藥蛋白表達(dá)宿主的主因。其中，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese?Hamster?Ovary?Cell，CHO)是用于真核生物外源基因表達(dá)最為成功的宿主細(xì)胞，已有越來(lái)越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達(dá)，很多人用重組蛋白藥物已上市。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，如擁有完備的翻譯后加工過(guò)程，包括糖基化、羥基化，使表達(dá)的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性，且使表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分離純化。

不同哺乳動(dòng)物種屬之間的FSH蛋白的氨基酸序列同源性很高，例如，人FSHα鏈和β鏈與豬FSHα鏈和β鏈的氨基酸序列同源性分別為83％和96％，人FSH與牛FSH的氨基酸序列同源性高達(dá)88％，提示hFSH在其他哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。目前已有利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的人用藥物重組hFSH(Human?follicle-stimulating?hormone，簡(jiǎn)稱(chēng)hFSH)上市，但仍然存在如下問(wèn)題：首先，現(xiàn)有方法生產(chǎn)的重組hFSH表達(dá)量太低，制備過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)成本太高；其次，其半衰期短，需要頻繁注射給藥。因此，利用分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)方法，開(kāi)發(fā)具有生物活性和更長(zhǎng)半衰期的hFSH藥物是本領(lǐng)域的一個(gè)挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種長(zhǎng)效重組人促卵泡激素融合蛋白(Human?follicle-stimulating?hormone-Fc?fusion?protein，簡(jiǎn)稱(chēng)hFSH-Fc)、其制備方法及應(yīng)用，該重組hFSH-Fc融合蛋白應(yīng)用于動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，與現(xiàn)有生化提取產(chǎn)品相比，體內(nèi)半衰期更長(zhǎng)、藥效更好。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組hFSH-Fc融合蛋白，該融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSHβ亞基、CTP、hFSHα亞基、肽接頭(Linker，簡(jiǎn)稱(chēng)L)和人IgG2Fc變體(vIgG2Fc)，如SEQ?ID?NO：2所示(hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgG2Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白簡(jiǎn)述為hFSH-Fc。

所述的hFSHβ亞基的氨基酸序列去除了常規(guī)hFSHβ亞基中的1-18位氨基酸殘基，如SEQ?ID?NO：5所示。

所述的CTP(carboxy-terminal?peptide，羧基端肽)的氨基酸序列來(lái)自HCGβ鏈羧基末端的28-34個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選CTP為來(lái)自HCGβ鏈羧基末端的33個(gè)氨基酸殘基序列，如SEQ?ID?NO：4所示。

所述的hFSHα亞基的氨基酸殘基序列去除了常規(guī)hFSHα亞基中的1-24位氨基酸殘基，如SEQ?ID?NO：3所示。

所述的肽接頭含有2-20個(gè)氨基酸殘基，且肽接頭含有兩個(gè)或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，優(yōu)選的肽接頭氨基酸序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。

所述的人IgG?Fc變體為含有Pro33lSer突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。

以下具體介紹本發(fā)明的人IgG?Fc變體、肽接頭和CTP功能：

IgG?Fc變體