[發明專利]一種長效重組促卵泡激素及其應用

有效

• 申請號: 201310529898.7
• 申請日: 2013-11-01
• 公開（公告）號: CN103539862A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 侯永敏;吳茂柏;李屹晨;雷瑤;徐楨琦
• 申請（專利權）人: 廣州優聯康醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/20;C12N15/62;C12N15/85;A61K38/24;A61K47/48;A61P15/00
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1.一種重組hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSHβ亞基、CTP、hFSHα亞基、肽接頭和人IgG2Fc變體。?

2.根據權利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的hFSHβ亞基的氨基酸序列是去除了常規hFSHβ亞基中的1-18位氨基酸殘基之后的hFSHβSEQ?ID?NO：5所示的氨基酸序列；其中所述的CTP的氨基酸序列是來自HCGβ鏈羧基末端的28-34個氨基酸殘基，優選CTP為來自HCGβ鏈羧基末端的33個氨基酸殘基序列，如SEQ?ID?NO：4所示；其中所述的hFSHα亞基的氨基酸殘基序列是去除了常規hFSHα亞基中的1-24位氨基酸殘基之后的hFSHαSEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列；其中所述的肽接頭含有2-20個氨基酸，所述肽接頭存在于hFSHα亞基和人IgG?Fc變體之間，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸，優選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。?

3.根據權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgG2Fc變體為含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域。?

4.根據權利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。?

5.編碼根據權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQ?ID?NO：1所示。?

6.一種權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其步驟包括：?

1)構建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達載體：?

采用人工合成方法獲得編碼人hFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動物細胞表達載體，獲得含有hFSH-Fc融合蛋白基因的表達質粒；?

2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達：?

將含有hFSH-Fc融合蛋白的表達載體轉染到哺乳動物宿主細胞，篩選穩定表達hFSH-Fc融合的細胞株；?

3)高密度細胞培養重組hFSH-Fc融合蛋白：?

將上述篩選到的穩定細胞株轉入搖瓶或細胞反應罐進行大規模培養，當細胞密度達到1×10⁷個/mL時，將溫度由37℃降至33℃，在該溫度下培養直至表達產量不再增加；?

4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備：?

a)Protein?A親和層析：離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fc片段的特性，利用親和Protein?A柱層析；?

b)疏水層析柱純化：經疏水層析純化進一步去除上述Protein?A純化后目標蛋白中的雜?

質；?

所述的疏水柱包括Butyl?Sepharose4Fast?Flow，Octyl?Sepharose4Fast?Flow，Phenyl?Sepharose6Fast?Flow，Butyl-S?Sepharose6Fast?Flow，Butyl?Sepharose4B，Octyl?Sepharose?CL-4B，Phenyl?Sepharose?CL-4B。優選，Phenyl?Sepharose6Fast?Flow。?

7.根據權利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟1)中所述的基因表達載體為pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT或pCMV-DHFR，優選，pCDNA3；其中步驟2)中所述的細胞轉染方法包括電穿孔轉染方法、磷酸鈣轉染、脂質體轉染和原生質融合，優選，電穿孔轉染方法；所述的哺乳動物宿主細胞包括CHO，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0細胞，優選，CHO細胞，更優選，DHFR酶缺陷型CHO懸浮細胞(CHO?DHFR-)。?

8.根據權利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟3)中還包括在培養基中加入添加劑，優選，在基礎培養基加入100μM?Cu²⁺，feeding培養基加入2mM?Man?NAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。?