[發明專利]新霉素半定量金標快速檢測試劑盒及其檢測方法和應用

無效

• 申請號: 201310529332.4
• 申請日: 2013-10-31
• 公開（公告）號: CN103743908A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 王麗哲;唐慧林;何艷玲;趙瑜;王麗麗;于重楠;劉敏;李瑾
• 申請（專利權）人: 北京陸橋技術有限責任公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種新霉素金標快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括稀釋液、酶標板和試紙條，所述試紙條包括樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特征在于，所述金標抗體結合墊上包被有膠體金標記的新霉素單克隆抗體；所述硝酸纖維素膜中部包被有兩條檢測線和一條質控線，兩條檢測線分別設置有能與金標新霉素單克隆抗體進行特異性結合的不同濃度的新霉素蛋白偶聯抗原，質控線設置有羊抗鼠IgG單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒，其特征在于，所述稀釋液為含有表面活性劑的磷酸緩沖溶液。

3.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒，其特征在于，所述金標抗體結合墊上的膠體金標記的新霉素單克隆抗體由新霉素單克隆抗體與25nm的膠體金顆粒以物理的方法結合組成。

4.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上檢測線包被的新霉素蛋白偶聯抗原，靠近膠體金結合墊端的包被濃度為0.05mg/ml，靠近吸水墊端的包被濃度為0.1mg/ml，包被量均為1μL/cm。

5.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上質控線包被羊抗鼠單克隆抗體，濃度為1mg/mL，包被量為1μL/cm。

6.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒，其特征在于，所述樣品墊和金標抗體結合墊上包被有MAX線。

7.根據權利要求1所述的一種多殘留金標快速檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

（1）金標抗體結合墊的制備

①.空白膠體金的制備：

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒為25nm的膠體金溶液，具體方法為：在帶有磁力攪拌子的三角燒瓶中加入97.5ml雙蒸水和1ml1%氯金酸溶液加熱至沸騰并持續沸騰3～5min后，加入1.5mL1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續煮沸至液體呈現桔紅色，保持沸騰狀態10min后停止加熱，將燒瓶中的攪拌子取出，溶液置室溫充分冷卻后，冷藏備用；

②.膠體金標記抗體的制備：

取空白膠體金溶液100ml，加入濃度為0.1g/L的碳酸鉀溶液400～450μL，勻速緩慢攪拌7～10min后，在攪拌狀態下逐滴加入稀釋好的待標記抗體，1mL膠體金顆粒標記新霉素單克隆抗體的量為3ng，繼續攪拌30min后，離心，吸除上清，沉淀用金標抗體重懸液充分重懸；

③.金標抗體結合墊的制備：

將重懸好的金標抗體用金標抗體重懸液進行對倍稀釋后，按每條2ml的量包被于尺寸為30*1cm玻璃纖維素膜上，37℃干燥過夜，干燥后成金標抗體結合墊，于密封避光干燥處保存，使用時取出。

（2）硝酸纖維素膜上T、C線的包被

①.新霉素-蛋白偶聯物的制備

取16mg?NEO（新霉素）溶于1mL?PBS中，20mg?BSA（牛血清白蛋白）溶于1mLPBS中，將NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力攪拌器上攪拌,取EDC（水溶性碳化二亞胺）30mg溶于1.5mL?PBS中，將EDC液逐滴加入上述反應液中，攪拌反應2h，再將10mg?EDC溶于0.5mL?PBS中，逐滴加入，室溫攪拌反應24h.。將反應產物裝入透析袋透析3d，每8h換液一次，透析后分裝于-20℃貯存。

②.T、C線的包被

調試好三維噴點平臺，將2種高低不同濃度的新霉素蛋白偶聯物通過劃線的方式按順序包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線，同時進行羊抗鼠單克隆抗體的包被作為質控線，每條線間的間隔為5mm±0.1mm，37℃干燥2h，密封避光干燥處保存；

（3）試紙條的組裝

將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊按序搭接黏貼在PVC底板上，并在樣品墊和金標抗體結合墊的表面覆上MAX線，最后將貼好的底板在切條機上切割成寬為4mm的試紙條。

8.根據權利要求7所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述金標抗體重懸液包括四硼酸鈉、硼酸、蔗糖以及牛血清白。

9.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒檢測食品中新霉素殘留量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、樣本檢測

（1）取所需數量的微孔，置于微孔板上；

（2）向每個微孔中依次加入100μL樣品稀釋液和100μL待測樣品，混勻；

（3）向每孔中插入金標檢測條，等待5分鐘觀察結果，30分鐘后結果無效；

二、結果判斷

陰性：T線和C線均顯色，且無論顯色深淺都判斷為陰性，表示樣品中新霉素濃度低于200ppb或不含新霉素殘留；

陽性：C線顯色，同時T2線顯色而T1線不顯色，說明樣品的新霉素的殘留超過200ppb，但不高于400ppb；當C線顯色，而兩條T線均不顯色時，說明樣品中的新霉素含量超過400ppb；

無效：C線未顯色，無論T線有無顯色，均表明不正確的操作過程或檢測條已失效。10.如權利要求1-6任意一項所述的新霉素金標快速檢測試劑盒在食品檢測中的應用。