[發明專利]檢測DHFR的C829T單核苷酸多態性的引物和方法

有效

• 申請號: 201310528732.3
• 申請日: 2012-09-10
• 公開（公告）號: CN103695534A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳奕磊;徐建成;王淑一;孫翠蓮
• 申請（專利權）人: 濟南艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

本申請是申請號為201210331289.6、申請日2012年9月10日的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種DHFR的C829T單核苷酸多態性檢測試劑盒，采用基因測序技術，可以對DHFR（C829T）多態性位點進行檢測。

背景技術

骨髓抑制限制了多種化療藥物的應用，使之難以達到治愈或抑制腫瘤生長的效果，而一些耐藥基因是產生骨髓抑制的分子基礎，如二氫葉酸還原酶基因

(dihydrofolate?reductase，DHFR)。

DHFR是細胞內葉酸代謝的關鍵酶，分子量為22KD。在還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的參與下，DHFR能催化葉酸變成二氫葉酸，而后者為合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷輸送了碳元素，因此DHFR是DNA、RNA及蛋白質等物質合成的其中一種關鍵酶。此外，DHFR也是抗代謝類抗腫瘤藥物氨甲嘌呤（MTX）的靶酶。MTX是一種葉酸類似物，在臨床上常用來治療乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多種腫瘤。其作用原理是通過競爭性與DHFR的活性位點緊密結合而使其失活，從而導致細胞中四氫葉酸含量下降，細胞DNA合成異常，造成細胞死亡。但是在治療過程中一些腫瘤細胞很快對其產生耐藥性，骨髓抑制的毒副作用也較嚴重、限制了其療效。

DHFR基因的SNP是導致腫瘤細胞對MTX產生耐藥的一種因素。雖然MTX?可以競爭性地抑制DHFR，但是當MTX和DHFR親和力下降時，MTX抑制該酶的作用就會明顯下降。諸多研究表明在一些耐藥細胞中，由于DHFR基因中第829號核苷酸會發生T代替C的突變，即產生CC型（野生純合型）、CT型（雜合型）、TT?型（突變純合型）三種基因型，而后兩者導致了DHFR蛋白質結構的改變，進而影響DHFR與MTX結合的空間結構，最終引起DHFR和MTX親和力的下降，提高了細胞的抗藥性。吳瑞瓊等將含突變mDHFR的逆轉錄病毒上清轉染臍血?CD34+細胞之后進行細胞抗MTX分析，結果發現轉導mDHFR耐藥基因的臍血干細胞集落形成數明顯高于對照組，同時對MTX的抗性提高了約2倍。另有資?料顯示將轉導有人的突變mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后，再使用大劑量MTX治療，結果表明轉導有突變mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大劑量化?療的沖擊治療，并使44％的小鼠腫瘤完全消退，而對照組小鼠全部死亡。終上所述，正是由于DHFR中一個氨基酸的改變從而使細胞具有對MTX的耐受性。

因此，檢測腫瘤患者中DHFR（C829T）的基因型，有助于臨床醫生制定更具針對性的個體治療方案，獲得較佳效果的同時也減輕患者的經濟與身體負擔。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種DHFR的C829T單核苷酸多態性檢測試劑盒，可用于檢測DHFR(C829T)位點是否發生突變。

一種DHFR的C829T單核苷酸多態性檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、DNA提取液、PCR試劑、單鏈純化試劑和測序試劑,其特征在于：

PCR試劑包括特異性擴增引物SEQ?NO.1、SEQ?NO?.2，其序列為：

SEQ?NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，

SEQ?NO.2：Biotin-?AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；

測序試劑包括特異性測序引物SEQ?NO.3，其序列為：

SEQ?NO.3：AGTCCCCAGCACCTG。

進一步地，所述PCR試劑包括2*PCR?Buffer、10mM?dNTP、5U/μl??Taq?酶、特異性擴增引物SEQ?NO.1和SEQ?NO?.2、滅菌水；所述單鏈純化試劑包括鏈親和素包被的磁珠、70%（V/V）乙醇、變性液、1×Wash?Buffer、結合緩沖液、退火緩沖液；所述測序試劑包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物APS、熒光素及dNTP。

所述試劑盒的使用方法包括如下步驟：

（1）提取樣本中的DNA

（2）以DNA為模板，依據所述的特異性擴增引物（SEQ?NO.1、SEQ?NO.2）進行PCR擴增；

（3）將步驟（2）所得的PCR產物以所述的標記生物素的引物序列進行單鏈純化；

（4）將步驟（3）得到的單鏈純化產物進行測序；

（5）結果分析。

進一步地，步驟(2)的PCR反應按以下條件進行擴增：94℃?2min預變性；98℃?10s、58℃?30s、68℃?30s，40個循環；68℃?5min。