[發明專利]檢測DHFR的C829T單核苷酸多態性的引物和方法

有效

• 申請號: 201310528732.3
• 申請日: 2012-09-10
• 公開（公告）號: CN103695534A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳奕磊;徐建成;王淑一;孫翠蓮
• 申請（專利權）人: 濟南艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

1.檢測DHFR的C829T單核苷酸多態性的引物，其特征在于，所述引物包括特異性擴增引物SEQ?NO.1、SEQ?NO?.2，其序列為：

SEQ?NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，

SEQ?NO.2：Biotin-?AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。

2.如權利要求1所述的檢測DHFR的C829T單核苷酸多態性的引物，其特征在于，所述引物還包括特異性測序引物SEQ?NO.3，其序列為：

SEQ?NO.3：AGTCCCCAGCACCTG。

3.檢測DHFR的C829T單核苷酸多態性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）提取樣本中的DNA

（2）以DNA為模板，用特異性擴增引物（SEQ?NO.1、SEQ?NO.2）進行PCR擴增；

SEQ?NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，

SEQ?NO.2：Biotin-?AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；

（3）將步驟（2）所得的PCR產物以所述的標記生物素的引物序列進行單鏈純化；

（4）將步驟（3）得到的單鏈純化產物進行測序，測序引物為SEQ?NO.3；

SEQ?NO.3：AGTCCCCAGCACCTG；

（5）結果分析。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)的PCR反應按以下條件進行擴增：94℃?2min預變性；98℃?10s、58℃?30s、68℃?30s，40個循環；68℃?5min。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)?單鏈純化的具體步驟為：將得到的50ul?PCR產物與3ul?鏈親和素包被的磁珠及47ul?結合緩沖液混合，室溫孵育10~15min，期間震蕩2~3次，然后使用Vaccuum?prep?tool?吸取磁珠，將帶有磁珠的Vaccuum?prep?tool先后放進70%（V/V）乙醇、變性液、1×Wash?Buffer中清洗10s左右，再將Vaccuum?prep?tool放入含有49ul?退火緩沖液及1ul?測序引物（SEQ?NO.3）的96孔板中，釋放磁珠，將該96孔板放置于80℃?2min，再冷卻至室溫，即得到測序反應所需的單鏈純化產物。