[發明專利]一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶

有效

• 申請號: 201310528691.8
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103540570A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 應漢杰;朱夢珠;謝婧婧;孫梧進;王艷;郭亭;朱晨杰;陳勇;陳曉春;吳菁嵐
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/30;C12R1/15
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種定點突變方法制備具有耐受高濃度三磷酸胞苷（CTP）的三磷酸胞苷合成酶(CTP合成酶，簡稱CTPS)。

背景技術：

胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)是一種高能磷酸化合物,是嘧啶合成途徑中非常重要的終產物。其參與機體細胞膜磷脂，卵磷脂等重要磷脂類化合物的合成代謝，也是合成DNA,RNA等重要物質前體。胞嘧啶核苷三磷酸合成酶(CTPs)在激活劑ATP,GTP,,Mg⁺及氨基供體（谷氨酰胺或者氨）等存在下，能以UTP為底物，生成CTP.反應方程式如下：

核昔酸在食品行業中,已經由最初的食品助鮮劑，擴展為具有提高生物體免疫功能的功能性食品添加劑，特別是在嬰幼兒食品中,核昔酸能有效增強嬰幼兒抵抗細菌性痢疾的能力,減少腹瀉的發生。同時，核昔酸在抗癌，抗病毒，治療心血管疾病、糖尿病及干擾誘導等方面具有獨特的療效，被用于多種藥物的合成。CTP其能調節經神經氣膜的合成改建，特別是突觸內重要成分的新陳代謝，因此具有激活和促進受損神經組織再生和修復的功能，延緩死亡，提高神經細胞抗損傷能力、改善脂肪代謝、緩解血管硬化等作用。馮永哥等人用CTP治療新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)34例,效果良好；駱文龍等人用CTP治療突發性聾，臨床療效肯定,按該組劑量暫未發現副作用；李小苗等人發現三磷酸胞二鈉在改善糖尿病周神經病變的癥狀神經傳導速度方面近期療效肯定,顯效80%，有效16%，總有效率96%，而作用溫和,毒副作用小,是一種安全有效的促進神經細胞修復與再生的藥物。

20世紀60年代初，日本的國中明率先發現了利用橘青霉提取的5’-磷酸二醋酶可以降解RNA生成5’-核苷酸，隨后,日本利用該方法首先開始了核昔酸的工業化生產。在幾十年的研究中,已形成生產核昔酸及其衍生物的多種方法,歸納起來主要有以下4種：化學合成法、R?NA酶解法、微生物發酵法以及生物催化法

在嘧啶核苷酸合成途徑中，可在三個關鍵點上受到終產物的反饋抑制。一個是合成途徑中的第一個調節酶氨甲酰磷酸合成酶，它受到UMP的反饋抑制。而另外兩個是天冬氨酸轉氨甲酰酶和CTP合成酶受到產物CTP的反饋抑制。

同源建模法是蛋白質三維結構預測的主要方法，對于一個未知結構的蛋白質，首先通過同源分析找到一個已知結構的同源蛋白質，然后，以該蛋白質的結構為模板，為未知結構的蛋白質建立結構模型。通過計算機模擬技術搭建蛋白質結構模型，對結構進行優化，并對蛋白質結構模型進行合理性評估，藉此獲得蛋白質的空間結構信息，幫助解決X-射線衍射和NMR無法克服的問題，并節省了大量的時間。

定點突變技術是利用合成的寡核苷酸作為誘變物，在已知的核苷酸序列中準確改變一個或多個堿基，進而改變組成蛋白質的一個或多個氨基酸殘基，以研究蛋白質結構和功能的關系。近年來，定點突變技術在基因工程改造中發揮著巨大作用，在提高酶活，研究酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。然而將該技術應用在CTP合成發面還鮮有報道，因此，利用定點突變改造來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032CTP合成酶具有極佳的理論指導意義和應用價值。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是提供一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶，主要利用是同源建模和定點突變的方法對谷氨酸棒桿菌ATCC13032的CTP合成酶進行定向改造。使改造后的CTP合成酶酶活相對提高，抗抑制能力增強，進一步使改造后的CTP合成酶高效表達，最終達到大量生產CTP的要求。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

具體來說，上述定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶是由氨基酸序列為SEQ?ID?NO：4所示的來源于谷氨酸棒桿菌ATCC13032的三磷酸胞苷合成酶進行定點突變改造得到，其第160位氨基酸由天冬氨酸突變成了谷氨酸(D160E)，第162位氨基酸由谷氨酸突變成了丙氨酸（E162A），第168位氨基酸由谷氨酸突變成了賴氨酸(E168K)。

編碼上述定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。

一種重組質粒，其包含了上述核苷酸序列。