[發(fā)明專利]一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發(fā)酵方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310526159.2
• 申請(qǐng)日: 2013-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN103589769A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明麗;趙俊;陳琨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王明麗;趙俊
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02
• 代理公司: 安徽合肥華信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明主要涉及一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

干擾素（interferon，IFN）是病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長(zhǎng)繁殖及發(fā)揮抗腫瘤的活性。按照干擾素的產(chǎn)生細(xì)胞、生化特征及在機(jī)體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為α、β、γ三類。α型干擾素在體內(nèi)外能發(fā)揮廣譜、高效抗病毒作用的機(jī)制主要是抑制病毒蛋白質(zhì)的合成，并能選擇性地作用于受感染細(xì)胞，且在使用后無(wú)任何藥物殘留。目前全球已有60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)應(yīng)用人基因工程重組干擾素制劑治療大約30多種病毒性疾病。

動(dòng)物用干擾素的研究目前已得到不少成果，畜牧業(yè)生產(chǎn)上的研究及應(yīng)用已受到高度關(guān)注。最早在國(guó)內(nèi)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床的是動(dòng)物白細(xì)胞干擾素，由于這種干擾素需采用生化分離的方法獲得，工藝成本高，規(guī)模化生產(chǎn)困難等。而基因工程技術(shù)的發(fā)展為動(dòng)物用干擾素大量生產(chǎn)提供了新的平臺(tái)。自1986年Lefevre首次克隆出豬α干擾素（porcine?interferon?alpha，PoIFNα）基因以來，迄今已有多種獸用干擾素基因被克隆、表達(dá)和進(jìn)行生物學(xué)功能研究。我室采用基因工程技術(shù)獲得了一種重組豬干擾素ɑ（重組豬α干擾素的制備方法，專利號(hào)2008100201804），臨床試用結(jié)果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。

目前基因工程重組豬干擾素ɑ規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)存在如下問題：1）表達(dá)的豬干擾素ɑ蛋白多是以無(wú)活性的包涵體形式存在，必須在純化過程中增加變復(fù)性步驟，既增加了生產(chǎn)成本，又影響了蛋白質(zhì)生物學(xué)活性；2）?基因工程重組豬干擾素ɑ表達(dá)量低，效價(jià)不高難以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。

本發(fā)明以自行構(gòu)建的重組大腸埃希菌BL21/?pET-32a-rPoIFNα1作為生產(chǎn)菌種，采用本發(fā)酵方法，在發(fā)酵細(xì)菌破碎上清中獲得目的蛋白，不產(chǎn)生包涵體，省去了包涵體變性、復(fù)性等步驟，最大程度上保證了rPoIFNα1生物學(xué)活性，并采用超濾濃縮技術(shù)粗純蛋白，縮短了生產(chǎn)周期。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的就是為了彌補(bǔ)已有技術(shù)的缺陷，提供一種。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟：

（1）種子菌培養(yǎng)：將---18-?-20℃保存的工作種子菌的菌種接種種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進(jìn)行培養(yǎng)；控制轉(zhuǎn)速215~220r/min，培養(yǎng)溫度37℃，初始pH值6.8~7.2，培養(yǎng)時(shí)間9.5~10h；

（2）發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按接種量1~2%接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基量為18~22L，即向發(fā)酵罐中通入無(wú)菌空氣，通氣量為1.4~1.6L/min，保持發(fā)酵罐內(nèi)的含氧量在10~20%，設(shè)定培養(yǎng)溫度35~38℃，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制發(fā)酵pH在7.0~7.1；

（3）補(bǔ)料：發(fā)酵2~3h，紫外分光光度儀測(cè)定OD₆₀₀為0.4~1.0后，每隔一小時(shí)添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g，（NH₄）₂SO_4?1~5g，添加2~4次；

（4）誘導(dǎo)：補(bǔ)料2~3h后，紫外分光光度儀測(cè)定OD₆₀₀為1.0時(shí)，一次性添加濃度為50~100g/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)補(bǔ)料液5-40ml，蛋白胨10-50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，（NH₄）₂SO_4??2~10g，然后將溫度調(diào)至32℃進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)4~6h；

（5）革蘭染色及菌體濕重的測(cè)定：誘導(dǎo)表達(dá)4~6h后，發(fā)酵結(jié)束，收集菌液，經(jīng)革蘭染色初步檢測(cè)菌體形態(tài)，并在轉(zhuǎn)速為7000r/min，溫度為4℃的條件下離心12~16min后，取菌體沉淀物，測(cè)定菌體濕重，范圍應(yīng)在0.0200~0.0250g/ml；

（6）第一次離心：在轉(zhuǎn)速為7000r/min，溫度為4℃的條件下離心13~16min后留取菌體沉淀；

（7）重懸沉淀的菌體：重懸時(shí)每100g濕重菌體加1L的1×PBS（NaCl?8g/L，KCl?0.2g/L，Na₂HPO₄?2.9g/L，KH₂PO₄?0.2g/L）；