[發明專利]一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發酵方法

有效

• 申請號: 201310526159.2
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103589769A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 王明麗;趙俊;陳琨
• 申請（專利權）人: 王明麗;趙俊
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

1.一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發酵方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）種子菌培養：將---18~-20℃保存的工作種子菌的菌種接種種子培養基中，使用回轉恒溫調速搖床進行培養；控制轉速215~220r/min，培養溫度36~38℃，初始pH值6.8~7.2，培養時間9.5~10h；

（2）發酵：將培養好的種子液按接種量1-2%接入發酵罐進行發酵，發酵培養基量為18~22L，即向發酵罐中通入無菌空氣，通氣量為1.4~1.6L/min，保持發酵罐內的含氧量在10~20%，設定培養溫度37℃，機械攪拌轉速為210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制發酵pH在7.0~7.1；

（3）補料：發酵2~3h，紫外分光光度儀測定OD₆₀₀為0.4~1.0后，每隔一小時添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g，（NH₄）₂SO_4?1~5g，添加2~4次；

（4）誘導：補料2~3h后，紫外分光光度儀測定OD₆₀₀為1.0時，一次性添加濃度為50~100g/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)補料液5~40ml，蛋白胨10~50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，（NH₄）₂SO_4??2~10g，然后將溫度調至32℃進行目的蛋白的誘導表達4~6h；

（5）革蘭染色及菌體濕重的測定：誘導表達4~6h后，發酵結束，收集菌液，經革蘭染色初步檢測菌體形態，并在轉速為7000r/min，溫度為4℃的條件下離心12~16min后，取菌體沉淀物，測定菌體濕重，范圍應在0.0200~0.0250g/ml；

（6）第一次離心：在轉速為7000r/min，溫度為4℃的條件下離心13~16min后留取菌體沉淀；

（7）重懸沉淀的菌體：重懸時每100g濕重菌體加1L的1×PBS（NaCl?8g/L，KCl?0.2g/L，Na₂HPO₄?2.9g/L，KH₂PO₄?0.2g/L）；

（8）破碎菌體：用機械破碎的方法，破碎時用800?bar的壓力連續對菌體沖撞3~4遍，經革蘭氏染色，檢測破菌率達到95%以上；

（9）第二次離心：在轉速為12000r/min，溫度為4℃的條件下離心14~16min后取上清液；

（10）超濾濃縮：將第二次離心得到的上清液使用0.22μm孔徑的膜包進行超濾收集通過膜包的下游液體，再用30kD孔徑的膜包進行10倍濃縮，收集未通過膜包的上游液體，即為rPoIFNα1的粗制品。

2.根據權利要求1所述的一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發酵方法方法，其特征在于所述種子培養基的組成為：工業級蛋白胨1~10g/L，工業級酵母粉1~5g/L，NaCl1~10g/L，pH5.1~7.1。

3.根據權利要求1所述的重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發酵方法方法，其特征在于所述發酵培養基的組成為：工業級蛋白胨1~10g/L，工業級酵母粉1~5g/L，葡萄糖0.1~1g/L，NaCl?1~10g/L，甘油0.1~3.33ml/L,消泡劑0.01~0.33ml/L。