[發明專利]一種直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201310526045.8
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103751796A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 王明麗;李增;趙俊;王彩玲
• 申請（專利權）人: 王明麗;李增
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K38/21;A61P31/12
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

本發明涉及生物醫藥與化工領域，具體涉及一種攜帶標記蛋白的重組豬α干擾素聚乙二醇偶聯物的制備方法，以及其在制備用于獸用抗病毒藥物中的用途。?

背景技術

PEG（聚乙二醇）是一種中性、水溶性、無毒性的聚合物。它是少數幾個被FDA批準的可用于體表和體內的聚合物，在食品、化妝品、個人保健和醫藥行業廣泛應用。PEG的特性是由其溶于水中的行為所揭示，在水溶液中長鏈的PEG分子，具有高水合性（即水分子結合到它表面）。PEG的重要特性是可以附著到其他分子和表面上，提供了一個生物相溶的、保護性外殼。這種保護性外殼降低了生物系統中（如人體）這些材料的清除，極大的降低了蛋白質、細胞和細菌的吸附，降低了腎臟的清除率。PEG在水和許多有機溶劑中可溶，在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成雙相系統。在乙醚和碳水化合物如己烷中不溶。雙功能PEG的水溶性、無毒性、高柔性和特征明確的化學特性，使它成為理想的修飾蛋白類產品的交聯材料。PEG與干擾素的偶聯已廣泛應用于用于臨床。如先靈葆雅公司開發的聚乙二醇化人干擾素α-2β（商品名，佩樂能，PegIntron）；羅氏公司開發的聚乙二醇化人干擾素α-2α（商品名，派羅先，PegasyS）等。已經證實被偶聯后的干擾素，生物學活性大部分得以保留，同時免疫應答極大地降低，血清半衰期也極大地得到了延長。?

動物α型干擾素對畜禽病毒性疾病具有較好的防治效果。安徽醫科大學微生物學教研室王明麗教授課題組采用基因工程技術克隆并表達了豬α型干擾素，并將實驗室合格產品制成凍干粉針劑發送至安徽省多家養豬場進行臨床試驗。結果證明，該室研制的重組豬α干擾素能有效治療豬犬病毒性疾病。對治療豬病毒性腹瀉有效率為83.5%，治愈率為63.9%（中國發明專利CN101289666Α）。這一項目在產業化進程中。在該項目的基礎上，對重組豬α干擾素進行聚乙二醇化修飾，以獲得長效制劑，從而延長藥物在體內循環半衰期、減少體內清除率，減少給藥次數、降低動物的應激性、增強療效、降低用藥成本。作為新型獸藥的開發這一項目有重要的學術價值和應用前景，同時具有較高的社會效益和經濟效益。?

發明內容

本發明目的就是為提供一種一種直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物、制備方法及其應用。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

一種直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物，它具有如下結構式：?

式中，mPEG為聚乙二醇鏈，Protein為N端攜帶標記蛋白重組豬α干擾素（TRX-HIS-Interferon）。?

一種直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物，所述的干擾素是N端攜帶標記蛋白重組豬干擾素（TRX-HIS-Interferon,Mw=39KD）。?

一種直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物，所述的聚乙二醇部分是分子量為2-30KD的直鏈聚乙二醇。?

一種直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物的制備方法，包括以下步驟：?

（1）將干擾素用5mM?pH3.0-5.0的磷酸二氫鉀緩沖液稀釋到0.1mg/ml；?

（2）加入計算量的干擾素，用NaOH溶液調節pH值到8.0，冰浴保存，按干擾素：mPEG為1:20的物質的量加入1/4量的mPEG-SC，在0-4℃條件下反應，隨后每間隔2h加入1/4量的mPEG-SC，加入完畢后繼續反應4-8h，所述的mPEG-SC有如下結構：?

（3）加入0.75Μ的甘氨酸終止反應；?

（4）取上述反應液少許，通過SDS-PAGE計算反應率，隨后進行純化，所述的純化包括以下步驟：?

（1）將上述反應液用5-10倍量體積、濃度為50mM?pH7.2的醋酸鈉緩沖液?稀釋，然后將稀釋液上羧甲基纖維素柱（Waterman?CM-52），以5倍體積pH7.2的醋酸鈉緩沖液洗柱后，用含0.5M?NaCl的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含PEG-干擾素的洗脫液，濃縮；?

（2）用Superdex200對（1）中得到PEG-干擾素進一步純化，洗脫液為pH7.2的醋酸鈉緩沖液（含0.2M?NaCl），收集含PEG-干擾素的洗脫液，濃縮。?

直鏈聚乙二醇-重組豬α干擾素偶聯物，該藥物可以用在制備獸用抗病毒藥物中。?

本發明的優點是：?