[發明專利]一種高山被孢霉重組基因表達系統及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310524221.4
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103571762A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 陳永泉;陳衛;郝光飛;陳海琴;郝丹輝;趙山山;趙建新;顧震南;張灝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12P7/64;C12R1/645;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 劉秀娟

【技術領域】

本發明涉及一種高山被孢霉的重組基因表達系統及其構建方法和應用，屬于生物工程技術領域。?

【背景技術】

高山被孢霉是一種重要的產油絲狀真菌，它具有花生四烯酸（AA）含量高、安全、多不飽和脂肪酸（PUFAs）組成合理等特點，已經應用于工業生產AA。目前對高山被孢霉高產菌株的研究主要集中在菌種選育和發酵條件優化等方面。由于缺乏一種有效的高山被孢霉的基因操作系統，目前還不能對這種極具價值的絲狀真菌進行遺傳改造。這就為高山被孢霉脂肪酸合成途徑的基礎理論研究和基因工程生產菌株的構建構成了不可逾越的障礙。?

絲狀真菌的基因操作系統一直落后于其它物種而沒有被很好地建立起來，主要歸咎于絲狀真菌難以被轉化的特點。尤其以具有高山被孢霉這類特點的真菌最難以被轉化：多核，無隔，產孢能力低且對抗生素不敏感。因此，國內一直未見這種重要的工業生產微生物遺傳改造的報道。除了不同絲狀真菌種類自身的特點及偏好性，轉化方法的選擇也是決定絲狀真菌能否被轉化的關鍵因素。目前，絲狀真菌的轉化和方法主要由以下幾種：原生質體轉化，電穿孔轉化，基因槍轉化和農桿菌介導轉化方法。其中，原生質體轉化和電穿孔轉化需要將受體的細胞壁降解制備原生質體，培養難度大，再生頻率低且實驗周期長。基因槍轉化雖然具有簡單便捷的優點，但是需要較大的受體基數且轉化成本過高。農桿菌的轉化技術作為一種最早被應用于植物的常規轉化技術，早在20年前就已經被報道具有轉化真菌的能力。到目前為止，農桿菌的轉化技術已經成功的應用到超過一百二十多種真菌。和其它轉化方法相比，農桿菌轉化方法具有幾個突出優點：受體細胞廣泛，可以是孢子或菌絲，且不需要制備原生質體；轉化效率高，成功率高，載體可容納大片段的異源DNA；基本上為單拷貝隨機插入宿主染色體中；可以提高同源重組效率。因此，根癌土壤桿菌的轉化方法為高山被孢霉表達系統的構?建提供了重要的操作手段。?

蘋果酸酶（malic?enzyme；EC1.1.1.40），催化細胞內蘋果酸生成丙酮酸的反應，是生物體內一種重要的NADPH產生來源。早在上世紀九十年代，蘋果酸酶就被推測為產油絲狀真菌脂肪酸合成途徑中的重要因素。在另外一種同屬于接合菌亞門的絲狀真菌—卷枝毛霉中，蘋果酸酶的活性在被芝麻粉（一種特異性抑制卷枝毛霉蘋果酸酶活的化學抑制劑）抑制的情況下，細胞內總脂肪含量受到了顯著影響。在英國赫爾大學Colin教授等人的相關研究基礎上，蘋果酸酶被推斷為產油真菌脂肪酸合成過程中的重要限速步驟。隨后，在對高山被孢霉發酵過程中一系列產生NADPH的酶活的系統研究中，蘋果酸酶也被推測與高山被孢霉細胞內脂肪酸合成密切相關。但是，由于缺乏一種有效的重組基因表達系統，此種理論在高山被孢霉中一直沒有得到驗證和應用。本發明以申請號為201310347934.8的專利申請中公開的Mortierella?alpina?ATCC32222尿嘧啶營養缺陷型菌株作為轉化菌株，在其基礎上通過進一步的基因重組方法構建了一種新的能夠高表達重組蘋果酸酶的遺傳表達系統。申請號為201310347934.8的專利申請所公開的全部內容均引入本申請作為參考。?

中國專利申請201310347934.8公開的技術方案包括一種高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株，該菌株是通過失活Mortierella?alpina?ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的ura5基因構建而成的。?

所述高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株，ura5基因的失活是通過缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而實現的。?

中國專利申請201310347934.8還公開一種制備上述高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株的方法，通過同源重組使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失從而使ura5基因失活，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具體步驟為：首先獲得ura5敲除基因片段，并進一步構建敲除質粒pBIG4KOura5，然后用重組質粒pBIG4KOura5轉化根癌土壤桿菌，最后用經轉化的含質粒pBIG4KOura5的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉并對轉化后的高山被孢霉進行篩選和鑒定，獲得尿嘧啶營養缺陷型菌株。?

所述方法使用的根癌土壤桿菌為：Agrobacterium?tumefaciensC58C1。?

基因敲除使用的根癌土壤桿菌起始載體為：pBIG2RHPH2。?

基因敲除載體構建的具體步驟如下：?