[發(fā)明專利]一種高山被孢霉重組基因表達系統(tǒng)及其構建方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310524221.4
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103571762A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳永泉;陳衛(wèi);郝光飛;陳海琴;郝丹輝;趙山山;趙建新;顧震南;張灝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12P7/64;C12R1/645;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權代理事務所 11305
• 代理人: 劉秀娟

1.一種過量表達蘋果酸酶基因的同源重組高山被孢霉菌株，其特征在于，該菌株是用含蘋果酸酶基因的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構建而成的。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種過量表達蘋果酸酶基因的同源重組高山被孢霉菌株，其特征在于，該菌株是用包含質粒pBIG2-ura5s-malE1或質粒pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構建而成的。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種過量表達蘋果酸酶基因的同源重組高山被孢霉菌株，其特征在于，該菌株是用重組質粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2轉化根癌土壤桿菌后，進一步用經(jīng)轉化的含質粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構建而成的，其中的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之間共18bp的序列缺失的Mortierella?alpina?ATCC32222菌株。

4.一種構建權利要求1或2所述的同源重組高山被孢霉菌株的方法，其具體步驟如下：

a)提取Mortierella?alpina?ATCC32222菌株的RNA，通過反轉錄獲取cDNA,利用PCR擴增分別獲取ura5基因、內含子DNA片段IT、蘋果酸酶1基因malE1和蘋果酸酶2基因malE2；

b)分別構建重組質粒pBIG2-ura5s-malE1和pBIG2-ura5s-malE2；

c)分別用構建獲得的重組質粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2轉化根癌土壤桿菌；

d)分別用經(jīng)過轉化的含質粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株；

e)篩選鑒定轉化菌株，獲得過量表達蘋果酸酶1或2基因的同源重組高山被孢霉菌株。

5.一種根據(jù)權利要求4所述的構建同源重組高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步驟c）中所使用的根癌土壤桿菌為：Agrobacterium?tumefaciens?C58C1。

6.一種根據(jù)權利要求5所述的構建同源重組高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步驟d）中所使用的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之間共18bp的序列缺失的Mortierella?alpina?ATCC32222菌株。

7.一種根據(jù)權利要求6所述的構建同源重組高山被孢霉菌株的方法，其特征在于構建pBIG2-ura5s-malE1時，先利用ura5基因構建轉化質粒pBIG2-ura5s，再利用轉化質粒pBIG2-ura5s和蘋果酸酶1基因malE1進一步構建重組質粒pBIG2-ura5s-malE1；構建pBIG2-ura5s-malE2時，先利用轉化質粒pBIG2-ura5s和IT基因片段構建轉化質粒高山被孢霉基因操作通用載體pBIG2-ura5s-ITs，再利用轉化質粒pBIG2-ura5s-ITs和蘋果酸酶2基因malE2進一步構建重組質粒pBIG2-ura5s-malE2。