[發明專利]含有尿素類氮源的發酵培養基及其用于生產次級代謝產物、酶和重組蛋白的用途

有效

• 申請號: 201310522914.X
• 申請日: 2009-02-05
• 公開（公告）號: CN103642843B
• 公開（公告）日: 2017-03-01
• 發明（設計）人: 桑賈伊·蒂瓦里;穆克什·巴布阿帕·帕塔勒;沙魯巴·加格;馬揚克·庫馬·加格;蘇勒克哈·約希;奇特納利·拉梅高達·那文·庫馬;比馬爾·庫馬;安努杰·格爾;哈里什·耶爾
• 申請（專利權）人: 拜康有限公司
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/20;C12N1/14;C12P1/02;C12P1/04;C12N9/00;C12P21/00;C12R1/19;C12R1/845
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 黎艷

本發明是申請日2009年2月5日、標題為“含有尿素類氮源的發酵培養基及其用于生產次級代謝產物、酶和重組蛋白的用途”申請號200980112059.7的分案申請。

技術領域

本發明描述了碳酸酰胺如尿素或其衍生物、氨基甲酸酯（鹽）類、碳二亞胺和硫脲作為發酵培養基中的含氮補充物的用途，該發酵培養基使用甲醇誘導型真菌表達體系如畢赤酵母（Pichia）來生產重組蛋白以實現提高的生物轉化率和肽（如胰島素和胰島素類似物）、醋酸艾塞那肽（exendin）和酶（如脂酶）。具體而言，本發明的重要方面涉及一種具有優化營養培養基參數的簡易發酵方法，該方法能夠導致在較短的生產周期中得到高產率。本發明的原則也可適用于通過適合表達有機體的發酵來生產各種蛋白和次級代謝產物。

背景技術

酵母基表達體系如巴斯得畢赤酵母（Pichia?pastoris）普遍用于表達重組蛋白Cregg,J.M.et?al.,in?Dev.Ind.Microbiol.29:33–41;1988。巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）表達體系使用甲醇誘導型醇氧化酶（AOX1）啟動子，其控制編碼醇氧化酶表達的基因，該酶催化甲醇代謝的第一步Cregg?J?M.et?al.in?Bio/Technology11:905–910;1993。巴斯德畢赤酵母能夠具有高表達水平、有效分泌胞外蛋白、翻譯后修飾如糖基化、并且在生物反應器培養下在基本培養基中生長達到高細胞密度。

Invitrogen?Co.（加利福尼亞，圣地亞哥）的“畢赤酵母發酵方法指南（Pichia?fermentation?Process?Guidelines）”中描述了使用畢赤酵母進行補料分批發酵（fed?batch?fermentation）的方法，下文中將其作為對照。為了生產重組蛋白，使使轉化的巴斯德畢赤酵母在作為碳源的甘油上生長到期望的高細胞密度生物量。通過向培養物中加入甲醇來引發生產階段，其中甲醇是誘導劑和唯一的碳源。在生物量生成和產生階段，氨作為氮源用于控制pH。

盡管酵母表達體系具有各種優勢，但仍然需要優化營養上影響的物理化學環境，從而實現在生物反應器中高效和大量的重組蛋白生產。實現高特異性的生產率是高度期望的。其可以通過優化最初的培養基成分、甲醇加入策略以及工藝的理化參數而實現。已有報道稱其中硫酸銨、氨基磷酸、磷酸二銨、硝酸鉀、尿素、玉米漿、豆粕、棉籽粕、甘蔗和甜菜糖漿、蛋白胨，谷物的分解物等已被用作細菌、酵母和真菌生長的氮源。在微生物“生長”中使用不同碳源和氮源是現有技術。

但是，在現有技術的文獻中還未曾披露用于高效生產重組蛋白、肽和酶的具體限定的碳源和氮源的最優組合。例如，WO/2007/005646披露了通過在復合生長培養基上培養重組酵母來生產乙醇，其中復合生長培養基包含復合糖類以及各種較廉價的氮源如玉米漿、玉米提取物、酵母自溶物以及尿素。而且，這種方法不采用甲醇誘導型生長或生產機制，這與本發明所開發的生產重組蛋白的方法不同。同樣，美國專利第4,288,554號描述了一種僅用于非GMO假絲酵母（non?GMO?Candida）種生長的連續發酵方法，該方法使用尿素與其他氮源和基本鹽培養基相結合。現有技術中并沒有任何暗示或教導在可使用甲醇誘導GMO巴斯德畢赤酵母來高效生產重組蛋白以及肽（如人胰島素和其類似物）或酶（如脂酶）的發酵方法（分批、分批補料（fed?batch）、連續）過程中在何處可使用尿素。

人們出人意料的發現，所定義的發酵培養基的使用的特征在于受控加入特定的豐富和易溶氮源（如尿素），進一步優化尿素以及來自尿素水解產生的氨的殘余濃度，從而可以獲得更好的產物、更高的生產率以及使生產時間更短。

多年以前人們就知道可以利用大腸桿菌來生產重組蛋白，并且其表達系統也已經被清楚地研究和理解。基于大腸桿菌的表達系統被廣泛用于分子如GCSF、HGH、鏈激酶和很多其他相似生物制品的生產。對于重組蛋白的生產，以葡萄糖作為碳源使轉化的大腸桿菌生長至期望的高細胞密度生物量。通過使用所需的誘導劑誘導而引發生產階段，然后僅以最低的營養補料維持培養物直到發酵結束。