[發明專利]一種親和核酸分子的快速鑒定和分離方法

有效

• 申請號: 201310521776.3
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103540672A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 羅昭鋒;羅炎;歐惠超;周宏敏;張海燕
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳曉娜

技術領域

本發明涉及一種鑒定分離方法，特別是從一個混合的核酸分子庫中快速鑒定和分離出具有某種特性分子的方法。

背景技術

核酸分子包括DNA和RNA，在生命體中扮演著極為重要的角色。其中一部分核酸分子能夠與其它分子相互作用，通過這種相互作用來傳遞信息并發揮特定的功能。這種能夠與其它分子相互作用的核酸分子不僅在生命體中普遍存在，還可以通過體外篩選的方法，從而獲得具有特定功能的核酸分子。這種體外篩選技術被稱作SELEX(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment)技術，于1990年由美國的三個實驗室獨立發明。

不管是尋找生物體內具有特定功能的核酸分子，或是體外通過SELEX技術獲得具有特定功能的核酸分子，都是一項極其復雜、耗時費力的工作。常規的方法是先合成隨機的文庫分子，將靶分子與文庫分子在一定條件下混合，通過某種分離方法將未與靶分子結合的部分洗掉，留下與靶分子結合的分子。由于分離技術的效率、污染、非特異結合、PCR的非特異擴增等原因，這種步驟往往需要重復很多輪才能得到與靶分子結合的富集文庫分子。這些文庫依然是一個多分子的復雜混合物。從富集的文庫中鑒定出高親和力的單個序列是整個過程的限速步驟。目前主要有以下幾種方法：一是將富集后的文庫序列構建克隆，轉化大腸桿菌，然后挑取單個菌落，提取核酸并測序；通常要測試多個序列，然后比較分析得出可能性高的序列信息，進行化學合成，然后再進行親和力驗證。這是最普遍采用的方法。近年來由于高通量測序技術的進步，興起的另一種方法是將文庫分子全部進行測序，然后比較不同序列的豐度，通過生物信息學方法進行分析，得出優選的序列，再進行合成和驗證。這種方法，成本高昂，而且需要高通量的測序儀器，只有少數實驗室能夠采用這種方法；這種方法雖然無需經過克隆，但只能獲得序列信息，仍需要通過合成和親和力驗證，才能得到特定的分子。而且，由于不均等擴增，不同序列擴增效率不同等原因，導致高豐度的序列未必是高親和力的序列。所以，以上現有方法都無法快速直接獲得高親和力的單一序列核酸分子。

本發明建立了一種快速鑒定和分離特定核酸分子的方法，可以在不經過測序的條件下，直接獲得具有高親和力的單一序列核酸分子。

發明內容

本發明首先將經過富集的核酸分子庫，利用乳濁液核酸擴增(PCR)技術將復雜核酸分子庫中的單個核酸分子在一種微珠A表面實現放大擴增，確保每個微珠A上只有一種序列；然后將獲得的微珠A與偶聯有靶分子的另一種微珠B混合，經過充分的混勻與結合后，將未結合的微珠A洗去，最后收集微珠B，部分含有特殊序列分子的微珠A，由于與微珠B表面偶聯的靶分子結合，而被保留下來，這些微珠A上的特定核酸分子即為所需的單一序列分子。

上面中所述分離方法可以是磁力分離、重力分離或浮力分離中的一種；

上面中所述微珠A如果不是磁性微珠，B可以是磁性微珠，并利用磁性來分離微珠B；

上面中所述微珠A如果密度小于水，B則可以使用密度大于水的微珠；反之亦然；

如果需要鑒定雙鏈DNA分子與靶分子的結合，則PCR擴增完后無需解離雙鏈；如果需要鑒定單鏈的DNA分子與靶標結合，則需要將微珠A上的擴增產物解離成單鏈分子，解離方法可以通過加熱解離，也可以通過堿解離；

如果需要鑒定RNA分子與靶標的結合情況，首先要將RNA反轉錄成DNA分子，通過乳濁液PCR將DNA分子分散成單克隆，擴增到微珠A上；然后用液滴包裹微珠A并在液滴中完成RNA分子的轉錄過程；由于微珠A上偶聯有與RNA配對的引物，通過加熱變性可以將RNA通過與引物的雜交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再將微珠A與偶聯有靶分子的微珠B進行孵育結合；按照選自磁力分離、重力分離或浮力分離的方法分離復合微珠A-B，所得A微珠上的RNA即為與靶分子結合的單克隆RNA分子。

本發明的方法既是一種快速鑒定技術，也是一種快速篩選技術。將一定庫容的隨機文庫分子擴增到微珠上，解離成單鏈，用靶標分子結合，分離出與靶標分子結合的微珠，即相當于從原始的文庫中篩選出所需的分子。

本發明中微珠的挑取方法，可以采用顯微操作法，也可以利用分選流式進行篩選。如果靶分子是細胞表面的膜蛋白，微珠B可以直接用細胞代替。

綜上所述，本發明提供下述各項實施方案：

1.一種快速鑒定和分離核酸分子的方法，所述方法包括下述步驟：