[發明專利]一種親和核酸分子的快速鑒定和分離方法

有效

• 申請號: 201310521776.3
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103540672A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 羅昭鋒;羅炎;歐惠超;周宏敏;張海燕
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳曉娜

1.一種快速鑒定和分離核酸分子的方法，所述方法包括下述步驟：

(1)將待鑒定和分離的核酸分子的特異性引物之一偶聯到微珠A上，然后通過乳濁液PCR的方法，將文庫分子分散成單模板并且擴增到微珠A上；

(2)將擴增有單模板的微珠A與另一種偶聯有靶分子的微珠B混合，并移除未與微珠B結合的微珠A，回收微珠B，得到與微珠B上的靶分子特異性結合的微珠A，與微珠B上的靶分子特異性結合的每個微珠A上即結合有待鑒定和分離的單克隆的核酸分子。

2.權利要求1所述的方法，其中步驟(1)中引物與微珠A表面的偶聯為共價偶聯或非共價偶聯。

3.權利要求1所述的方法，其中步驟(1)中的引物預先用氨基修飾或用生物素修飾。

4.權利要求1所述的方法，其中步驟(2)中分離微珠A和A-B復合微珠的方法是磁力分離、重力分離或浮力分離中的任一種。

5.權利要求1所述的方法，其中微珠A為非磁性微珠，微珠B為磁性微珠，并利用磁力來分離微珠A與A-B復合物。

6.權利要求1所述的方法，其中微珠A的密度小于水，微珠B的密度大于水，并且微珠B與微球A結合后的整體密度仍大于水，利用離心方法來分離微珠A與A-B復合物，離心沉淀物中即包含A-B復合物。

7.權利要求1所述的方法，其中微珠A的密度大于水，微珠B的密度小于水，并且微珠B與微球A結合后的整體密度仍小于水，并利用離心方法來分離微珠A與A-B復合物，上清表面即包含A-B復合物。

8.權利要求1所述的方法，其中鑒定雙鏈DNA分子與靶分子的結合時，PCR擴增完后無需解離雙鏈；當鑒定單鏈DNA分子與靶分子結合時，需要將微珠A上的擴增產物解離成單鏈DNA分子。

9.權利要求1所述的方法，當鑒定RNA分子與靶分子的結合情況時，所述方法包括下述步驟：

(1)在微珠A上偶聯用于擴增DNA模板的引物序列和用于捕獲RNA分子的配對序列，其中用于捕獲RNA分子的配對序列末端進行封閉修飾，使其無法用于延伸擴增；

(2)將RNA分子反轉錄成DNA分子，通過乳濁液PCR將所述DNA分子分散成單克隆，擴增到步驟(1)得到的微珠A上；

(3)用液滴包裹步驟(2)得到的微珠A并在液滴中完成RNA分子的轉錄過程；由于所述微珠A上偶聯有用于捕獲RNA分子的配對序列，通過加熱變性可以將RNA通過與配對序列的雜交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再將微珠A與偶聯有靶分子的微珠B進行孵育結合；分離復合微珠A-B，即可獲得與靶分子結合的單克隆RNA分子。

10.權利要求1—9中任一項所述的方法，所述方法還包括對分離的單克隆分子進行測序的步驟。