[發(fā)明專利]一種血漿低豐度蛋白表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310520561.X
• 申請(qǐng)日: 2013-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN103543139A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林居強(qiáng);陳榮;黃祖芳;王靜;陳冠楠;馮尚源;李永增;謝樹森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/65
• 分類號(hào): G01N21/65
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)分析檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）檢測(cè)血漿中低豐度蛋白的方法。

背景技術(shù)

拉曼光譜是一種分子振動(dòng)光譜，是對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。拉曼光譜分析過程操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，是一種無損檢測(cè)，但是拉曼光譜信號(hào)微弱，易受自體熒光干擾，因此利用拉曼光譜技術(shù)直接進(jìn)行檢測(cè)存在一定局限性。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced?Raman?spectroscopy，簡(jiǎn)稱SERS)技術(shù)是一種常用的拉曼信號(hào)增強(qiáng)方法，當(dāng)分子吸附于某些粗糙金屬(如Au、Ag、Cu和Pt等)表面時(shí)，將產(chǎn)生局部電場(chǎng)增強(qiáng)或者電荷轉(zhuǎn)移，使得這些分子的拉曼散射強(qiáng)度增加10⁴～10¹⁴倍，這就是SERS效應(yīng)。SERS技術(shù)能淬滅生物分子熒光，獲得的信號(hào)理想，檢測(cè)所需功率較低，對(duì)生物組織樣品損傷小，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)。

人體血漿蛋白含有來源于幾乎所有細(xì)胞、組織、器官的蛋白，然而，血漿蛋白的豐度差異巨大，血漿中21種主要高豐度及中等豐度的蛋白，如白蛋白、IgG、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等占血漿總蛋白含量的99%以上，而其余的1%則由為數(shù)眾多的低豐度甚至極低豐度的蛋白質(zhì)組成。人體組織器官發(fā)生病變時(shí)，來自病變組織或細(xì)胞的蛋白會(huì)進(jìn)入到血液系統(tǒng)，這些蛋白質(zhì)與機(jī)體的病理、生理狀況密切相關(guān)，因此，對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析是發(fā)現(xiàn)與各種疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的最有價(jià)值樣本之一，這些蛋白質(zhì)大部分都是低豐度蛋白，然而，低豐度蛋白難于檢測(cè)，如何有效地檢測(cè)和分析低豐度蛋白一直是分析科學(xué)領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性的難題。難點(diǎn)主要在兩個(gè)方面，一是低豐度蛋白的含量低于分析儀器的檢測(cè)極限；另一方面，血漿蛋白中高、低豐度蛋白含量的差異巨大，往往可達(dá)10¹²之巨，低豐度蛋白的信號(hào)易被高豐度蛋白所掩蓋。

目前對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)方法主要有以下兩種：第一種方法是先通過二維凝膠電泳分離高、低豐度蛋白，再將分離得到的低豐度蛋白酶解后用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)分析；第二種方法是將高、低豐度蛋白先混合酶解后，色譜分離蛋白質(zhì)酶解后的肽段，最后對(duì)肽段進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析。上述方法都存在所需樣品量大，耗材昂貴，步驟繁復(fù)，耗時(shí)較長(zhǎng)等問題。另外質(zhì)譜分析易受洗脫液等因素的干擾，無法鑒定區(qū)分等質(zhì)量蛋白質(zhì)，而且質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，難于廣泛推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提出一種利用SERS技術(shù)檢測(cè)血漿低豐度蛋白表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法。本方法采用疏水性聚合物去除血漿中的高豐度蛋白后，利用印跡固定化基質(zhì)富集低豐度蛋白，利用SERS技術(shù)檢測(cè)獲取血漿低豐度蛋白表面增強(qiáng)拉曼光譜，建立多種癌癥血漿低豐度蛋白表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)多變量統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行聚類分析，獲得健康人與癌癥患者的血漿低豐度蛋白表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)應(yīng)的判別散點(diǎn)分布圖，據(jù)此實(shí)現(xiàn)不同癌癥的判別。本發(fā)明具有快速、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)，可有效地檢測(cè)到血漿中低豐度蛋白的表面增強(qiáng)拉曼光譜，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

（1）去除血漿高豐度蛋白

取疏水性聚合物于套有離心柱的收集管中，加入洗脫液，充分混勻，3000～6000rpm離心1～5min后，將收集管中的液體倒掉，重復(fù)三次得到經(jīng)洗脫液洗脫的疏水性聚合物。取血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入1～10倍體積量的洗脫液進(jìn)行稀釋，加入到含有經(jīng)洗脫液洗脫的疏水性聚合物的離心柱中，利用移液器反復(fù)抽吸充分混勻，置于搖床中200～350rpm震蕩10～15min，2000～5000rpm離心，去除沉淀物，收集上層的低豐度蛋白溶液。

（2）富集血漿低豐度蛋白

取印跡固定化基質(zhì)，按照印跡固定化基質(zhì)︰血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品為（1～2）g︰（10～20）μl的比例，與步驟（1）收集到的低豐度蛋白溶液混合，孵育8～15min，然后將印跡固定化基質(zhì)轉(zhuǎn)入漂洗液中浸泡10～20min，取出在室溫下吹干備用。

（3）低豐度蛋白SERS增強(qiáng)基質(zhì)混合液的制備

將步驟（2）吹干的印跡固定化基質(zhì)剪碎并收集于離心管中，加入冰醋酸進(jìn)行溶解，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆尸F(xiàn)為透明膠體狀態(tài)時(shí)，加入SERS活性金屬納米粒子，充分?jǐn)嚢瑁?2～65℃孵育15～30min，靜置分層，直至固相雜質(zhì)析出，制成低豐度蛋白SERS增強(qiáng)基質(zhì)混合液。

（4）血漿低豐度蛋白SERS光譜檢測(cè)

取低豐度蛋白SERS增強(qiáng)基質(zhì)混合液2～20μl進(jìn)行SERS檢測(cè)。