[發明專利]一種血漿低豐度蛋白表面增強拉曼光譜的檢測方法

有效

• 申請號: 201310520561.X
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103543139A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 林居強;陳榮;黃祖芳;王靜;陳冠楠;馮尚源;李永增;謝樹森
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明涉及蛋白質分析檢測領域，特別涉及一種利用表面增強拉曼光譜（SERS）檢測血漿中低豐度蛋白的方法。

背景技術

拉曼光譜是一種分子振動光譜，是對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息，并應用于分子結構研究的一種分析方法。拉曼光譜分析過程操作簡單快速，靈敏度高，是一種無損檢測，但是拉曼光譜信號微弱，易受自體熒光干擾，因此利用拉曼光譜技術直接進行檢測存在一定局限性。表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced?Raman?spectroscopy，簡稱SERS)技術是一種常用的拉曼信號增強方法，當分子吸附于某些粗糙金屬(如Au、Ag、Cu和Pt等)表面時，將產生局部電場增強或者電荷轉移，使得這些分子的拉曼散射強度增加10⁴～10¹⁴倍，這就是SERS效應。SERS技術能淬滅生物分子熒光，獲得的信號理想，檢測所需功率較低，對生物組織樣品損傷小，靈敏度高，可實現單分子檢測。

人體血漿蛋白含有來源于幾乎所有細胞、組織、器官的蛋白，然而，血漿蛋白的豐度差異巨大，血漿中21種主要高豐度及中等豐度的蛋白，如白蛋白、IgG、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、轉鐵蛋白等占血漿總蛋白含量的99%以上，而其余的1%則由為數眾多的低豐度甚至極低豐度的蛋白質組成。人體組織器官發生病變時，來自病變組織或細胞的蛋白會進入到血液系統，這些蛋白質與機體的病理、生理狀況密切相關，因此，對這些蛋白質進行檢測和分析是發現與各種疾病相關生物標志物的最有價值樣本之一，這些蛋白質大部分都是低豐度蛋白，然而，低豐度蛋白難于檢測，如何有效地檢測和分析低豐度蛋白一直是分析科學領域具有挑戰性的難題。難點主要在兩個方面，一是低豐度蛋白的含量低于分析儀器的檢測極限；另一方面，血漿蛋白中高、低豐度蛋白含量的差異巨大，往往可達10¹²之巨，低豐度蛋白的信號易被高豐度蛋白所掩蓋。

目前對低豐度蛋白的檢測方法主要有以下兩種：第一種方法是先通過二維凝膠電泳分離高、低豐度蛋白，再將分離得到的低豐度蛋白酶解后用質譜進行檢測分析；第二種方法是將高、低豐度蛋白先混合酶解后，色譜分離蛋白質酶解后的肽段，最后對肽段進行質譜檢測分析。上述方法都存在所需樣品量大，耗材昂貴，步驟繁復，耗時較長等問題。另外質譜分析易受洗脫液等因素的干擾，無法鑒定區分等質量蛋白質，而且質譜儀價格昂貴，難于廣泛推廣。

發明內容

本發明目的在于提出一種利用SERS技術檢測血漿低豐度蛋白表面增強拉曼光譜的方法。本方法采用疏水性聚合物去除血漿中的高豐度蛋白后，利用印跡固定化基質富集低豐度蛋白，利用SERS技術檢測獲取血漿低豐度蛋白表面增強拉曼光譜，建立多種癌癥血漿低豐度蛋白表面增強拉曼光譜數據庫，經多變量統計分析進行聚類分析，獲得健康人與癌癥患者的血漿低豐度蛋白表面增強拉曼光譜對應的判別散點分布圖，據此實現不同癌癥的判別。本發明具有快速、操作簡單、成本低廉等特點，可有效地檢測到血漿中低豐度蛋白的表面增強拉曼光譜，從而克服了現有技術中的不足。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

（1）去除血漿高豐度蛋白

取疏水性聚合物于套有離心柱的收集管中，加入洗脫液，充分混勻，3000～6000rpm離心1～5min后，將收集管中的液體倒掉，重復三次得到經洗脫液洗脫的疏水性聚合物。取血漿標準樣品，加入1～10倍體積量的洗脫液進行稀釋，加入到含有經洗脫液洗脫的疏水性聚合物的離心柱中，利用移液器反復抽吸充分混勻，置于搖床中200～350rpm震蕩10～15min，2000～5000rpm離心，去除沉淀物，收集上層的低豐度蛋白溶液。

（2）富集血漿低豐度蛋白

取印跡固定化基質，按照印跡固定化基質︰血漿標準樣品為（1～2）g︰（10～20）μl的比例，與步驟（1）收集到的低豐度蛋白溶液混合，孵育8～15min，然后將印跡固定化基質轉入漂洗液中浸泡10～20min，取出在室溫下吹干備用。

（3）低豐度蛋白SERS增強基質混合液的制備

將步驟（2）吹干的印跡固定化基質剪碎并收集于離心管中，加入冰醋酸進行溶解，充分攪拌直至完全呈現為透明膠體狀態時，加入SERS活性金屬納米粒子，充分攪拌，水浴42～65℃孵育15～30min，靜置分層，直至固相雜質析出，制成低豐度蛋白SERS增強基質混合液。

（4）血漿低豐度蛋白SERS光譜檢測

取低豐度蛋白SERS增強基質混合液2～20μl進行SERS檢測。