[發明專利]一種表達嗜熱內切葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構建方法

在審

• 申請號: 201310518103.2
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN104560755A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 田方;柳曉瑜;鄭春陽
• 申請（專利權）人: 天津強微特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

??一種表達嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構建方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

酶作為大分子的活性物質，以其獨有的催化特性，已被廣泛應用于化工、食品、環境等領域。但由于目前市場上應用的酶多為常溫酶，在高溫、強堿、強酸、高鹽等條件下容易變性失活，這在很大程度上限制了酶制劑的推廣及應用。目前，極端微生物以豐富的代謝類型和生活環境的多樣性，已經引起了科學界和企業界的極大興趣，從極端微生物中挖掘及開發新的酶源成為近十幾年工業生物技術領域研究的熱點之一。

目前在紡織應用領域（例如織物處理、洗滌、柔化、人造絲加工）中，國內多使用傳統的混合型纖維素酶制劑，其會對纖維主體結構造成不必要的損傷，較優選擇是使用只有內切纖維素酶活性的單一組分纖維素酶。而目前應用的單一組分纖維素酶多為中性纖維素酶，需要大量進口，且由于為常溫酶，在應用時需要先降溫再進行后續處理，帶來了工藝上的繁雜性和不便性。同時在紡織整理環境中不可避免地存在金屬離子、離子性染料及表面活性劑等將會對常溫酶的催化效率和穩定性產生影響，勢必延長了作業周期，增加了使用酶制劑工藝的生產成本。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構建方法。通過上述方法構建的重組畢赤酵母菌株能夠表達在高溫下具較強酶解活力的嗜熱內切-β-1,4-葡聚糖酶。此類酶具有明顯的水解結晶纖維素的能力且對不良環境具有較強的耐受性。此類新型酶制劑成功開發將不僅有利于提升國內酶制劑企業的新型酶產品開發的實力，還有助于紡織工業中尤其生物拋光（尤其棉制品）領域方面的技術改造及產業升級，減少環境污染及降低能量消耗，提升整體的國內技術實力。

本發明的技術方案為：

1.????以攜帶有嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因的質粒pET21a(Amp+)-?ph1171-sgc-mut-sd為模板，進行PCR擴增，引物：

5’1171SD-XhoI-F???

5’-CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3’

3’1171SD-NotI-R???

5’-TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3’

在嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Xho?I和Not?I兩個酶切位點，使用Tli?DNA聚合酶擴增得到大小為1168?bp的內切-β-1，4-葡聚糖酶基因。

2.????將上述通過PCR擴增得到的嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因及質粒pPICZα-A經Xho?I和Not?I雙酶切回收后，再經T4?DNA連接酶連接，插入到pPICZα-A的多克隆位點，轉化大腸桿菌DH5α，在Zeocin^TM?LB平板上篩選陽性轉化子并測序。

3.????將測序正確的陽性克隆培養，大量提取質粒后，采用Sac?I線性化并使用乙醇沉淀線性化產物，用于畢赤酵母轉導。

4.????重組表達載體pPICZα-A-ph1171-sgc-mut-sd經Sac?I完全酶切線性化后，電轉化巴斯德畢赤酵母?X33并涂布Zeocin^TM?YPDS平板，30?℃孵育平板3至7天，對轉化子進行Mut表型鑒定，得到Mut⁺菌株。

5.????將Mut⁺表型的轉化子點種到Zeocin^TM?（2000?μg/ml）YPDS平板，30℃孵育2天，篩選得到抗高濃度Zeocin^TM水平的重組酵母多拷貝重組子。

6.????將上述抗高濃度Zeocin^TM水平的重組酵母多拷貝重組子接種于25?ml?BMGY培養基（250?ml搖瓶）中，在30℃、250?rpm下培養至OD₆₀₀=3，然后在室溫、1500-3000?g條件下，離心5分鐘，收集細胞，去除上清，用BMMY培養基重懸細胞至OD₆₀₀=1。

7.????利用甲醇誘導表達72小時；其間每24小時補加甲醇至終濃度為0.5%，每12小時取樣1?ml，在室溫、最大轉速離心條件下，離心2分鐘，將上清轉移至單獨管中，利用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達。

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附圖說明