[發明專利]一種表達嗜熱內切葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構建方法

在審

• 申請號: 201310518103.2
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN104560755A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 田方;柳曉瑜;鄭春陽
• 申請（專利權）人: 天津強微特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種表達嗜熱內切葡聚糖酶的重組畢赤酵母的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1）以攜帶有嗜熱葡聚糖酶基因的質粒pET21a(Amp+)-?ph1171-sgc-mut-sd為模板，進行PCR擴增，引物：

5’1171SD-XhoI-F???

5’-CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3’

3’1171SD-NotI-R???

5’-TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3’

在嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因兩端分別引入Xho?I和Not?I兩個酶切位點，使用Tli?DNA聚合酶擴增得到大小為1168?bp的嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因；

2）將上述通過PCR擴增得到的嗜熱內切-β-1，4-葡聚糖酶基因及質粒pPICZα-A經Xho?I和Not?I雙酶切回收后，再經T4?DNA連接酶連接，插入到pPICZα-A的多克隆位點，轉化大腸桿菌DH5α，在Zeocin^TM?LB平板上篩選陽性轉化子并測序；

3）將測序正確的陽性克隆培養，大量提取質粒后，采用Sac?I線性化并使用乙醇沉淀線性化產物，用于畢赤酵母轉導；

4）重組表達載體pPICZα-A-ph1171-sgc-mut-sd經Sac?I完全酶切線性化后，電轉化巴斯德畢赤酵母?X33并涂布Zeocin^TM?YPDS平板，30?℃孵育平板3至7天，對轉化子進行Mut表型鑒定，得到Mut⁺菌株；

5）將Mut⁺表型的轉化子點種到Zeocin^TM?（2000?μg/ml）YPDS平板，30℃孵育2天，篩選得到抗高濃度Zeocin^TM水平的重組酵母多拷貝重組子；

6）將上述抗高濃度Zeocin^TM水平的重組酵母多拷貝重組子接種于25?ml?BMGY培養基（250?ml搖瓶）中，在30℃、250?rpm下培養至OD₆₀₀=3，然后在室溫、1500-3000?g條件下，離心5分鐘，收集細胞，去除上清，用BMMY培養基重懸細胞至OD₆₀₀=1；

7）利用甲醇誘導表達72小時；其間每24小時補加甲醇至終濃度為0.5%，每12小時取樣1?ml，在室溫、最大轉速離心條件下，離心2分鐘，將上清轉移至單獨管中，利用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達。