[發明專利]家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201310516484.0
• 申請日: 2013-10-28
• 公開（公告）號: CN103555761A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 趙萍;王鑫;謝康;衣啟營;馬三垣;夏慶友
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種家蠶基因重組表達載體，以及其在提高蠶絲纖維力學性能方面的應用。

背景技術

蠶絲纖維為蛋白質纖維，是一種在紡織工業、生物醫學等領域具有廣泛應用的纖維材料。但由于蠶絲蛋白結構上的缺陷，蠶絲纖維的力學性能相比合成纖維較差，從而制約了其在新型高分子纖維、特種材料等領域的應用。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種家蠶基因重組表達載體，目的之二在于提供該重組表達載體在提高蠶絲纖維力學性能方面的應用；目的之三在于提供利用該重組表達載體提高蠶絲纖維力學性能的方法。

為達到上述目的，經研究，本發明提供如下技術方案：

1.家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體，是將由家蠶前部絲腺特異性啟動子、家蠶鈣離子-ATP酶基因CDS序列和終止子組成的表達框插入含熒光報告基因的轉座載體中而制得；所述家蠶鈣離子-ATP酶基因CDS序列如SEQ?ID?No.1所示。

進一步，所述家蠶前部絲腺特異性啟動子為家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子或BmCP274啟動子，所述BmCP231啟動子序列如SEQ?ID?No.4中第1位至第1457位核苷酸所示，或者如SEQ?ID?No.4中第1位至第1511位核苷酸所示；所述BmCP274啟動子序列如SEQ?ID?No.9所示。

進一步，所述重組表達載體是將由家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子、家蠶鈣離子-ATP酶基因CDS序列和SV40終止子組成的表達框插入pBac[3xP3-EGFPafm]載體的Asc?I酶切位點而制得；所述BmCP231啟動子序列如SEQ?ID?No.4中第1位至第1511位核苷酸所示。

2.家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體在提高蠶絲纖維力學性能方面的應用。

3.利用家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體提高蠶絲纖維力學性能的方法，包括以下步驟：將家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體與編碼轉座酶的轉基因輔助載體等摩爾比混合，顯微注射入已解除滯育的產卵后2～5小時的蠶卵中，注射后的蠶卵用無毒膠水封口，25℃催青至孵化，孵化出的幼蟲采用人工飼料飼育，至成蟲后進行自交制種，再取卵期第7天的蠶卵，在顯微鏡下進行熒光檢測，篩選出在眼睛或神經特異發射熒光的轉基因個體，獲得轉基因家蠶，其生產的蠶絲纖維即為力學性能提高的蠶絲纖維。

本發明的有益效果在于：本發明構建了家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體，用家蠶前部絲腺特異性啟動子調控家蠶鈣離子-ATP酶在家蠶前部絲腺特異表達，將該重組表達載體顯微注射入家蠶蠶卵內獲得了轉基因家蠶陽性個體，對轉基因家蠶陽性個體的研究發現，鈣離子-ATP酶在mRNA和蛋白水平上都得到了過量表達，對轉基因蠶絲纖維進行力學拉伸試驗發現其力學性能得到顯著提高，紅外光譜分析發現轉基因蠶絲纖維的結構發生了變化。因而運用本發明構建的家蠶鈣離子-ATP酶基因重組表達載體可以改變蠶絲纖維的力學性能，有助于獲得更加優良的蠶絲纖維。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為轉基因家蠶的Southern?Blot檢測結果，其中1為轉基因家蠶基因組；2為非轉基因家蠶基因組。

圖2為轉基因家蠶的熒光定量PCR檢測結果，其中1為轉基因家蠶前部絲腺基因組，2為非轉基因家蠶前部絲腺基因組。

圖3為轉基因家蠶的Western?Blot檢測結果，其中1為非轉基因家蠶前部絲腺蛋白樣品，2為轉基因家蠶前部絲腺蛋白樣品。

圖4為轉基因蠶絲纖維的紅外光譜掃描結果，其中A為非轉基因蠶絲纖維，B為轉基因蠶絲纖維，曲線a為紅外吸收曲線，曲線b為紅外吸收值通過傅里葉去卷積化后形成的曲線，箭頭處為1660cm^-1的峰。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

優選實施例中使用的家蠶品種為大造，由西南大學家蠶基因資源庫提供。

一、家蠶鈣離子-ATP酶基因的克隆