[發(fā)明專利]雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的抗Wnt5a單克隆抗體與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310516066.1
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103555668A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 司維柯;張曉麗;趙宸;牛長(zhǎng)春;楊忠;吳韋銣;潘靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫化學(xué)、腫瘤生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及制備一種與人體細(xì)胞增殖、分化、黏附和遷移過(guò)程有關(guān)的分泌蛋白wnt5a，相結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤；由該雜交瘤產(chǎn)生的抗wnt5a單克隆抗體及其相應(yīng)產(chǎn)品可應(yīng)用于人白血病的診斷試劑或相關(guān)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

白血病是兒童和青年中最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右。我國(guó)白血病患者約為3～4人/10萬(wàn)人口，小兒的惡性腫瘤中以白血病的發(fā)病率最高，每年至少以3萬(wàn)到4萬(wàn)的速度增加。

目前，世界上治療白血病的主要方法是化療、骨髓移植和靶向治療等幾種。從醫(yī)學(xué)角度看，至今白血病的治療沒(méi)有一種完全有效的手段，尤其是容易復(fù)發(fā)。目前試驗(yàn)室診斷白血病最完善的方法是WHO制定的MICM分型診斷法，即細(xì)胞形態(tài)學(xué)（Morphology），免疫學(xué)（Immunology），細(xì)胞遺傳學(xué)（Cytogenetic）和分子生物學(xué)（Molecular?biology）檢查方法，目前主要包括：外周血和骨髓顯微鏡下形態(tài)；單克隆抗體鑒別細(xì)胞表面分化標(biāo)記；染色體檢查；基因診斷等。其中骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查仍為最經(jīng)典最可靠的方法，但要準(zhǔn)確分型診斷還需輔以其它方法，即ICM方法。在白血病療效和預(yù)后的判別方面也常以外周血和骨髓形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，但該方法結(jié)果判斷存在主觀誤差，檢驗(yàn)者判斷個(gè)體差異大，不便標(biāo)準(zhǔn)化；并且細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變總落后于基因水平和蛋白質(zhì)水平的改變，故不利于早期診斷；骨髓標(biāo)本采集有創(chuàng)傷性在監(jiān)控白血病療效和預(yù)后判斷時(shí)，需反復(fù)抽取病人骨髓進(jìn)行前后對(duì)照檢查，給病人造成很大痛苦，并且技術(shù)要求高，取材不便，每次抽取也存在部位差異，不能真實(shí)的反應(yīng)病人的病情變化。尋找新的可作為診斷白血病的標(biāo)志物、對(duì)腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、病情監(jiān)測(cè)以及預(yù)后的評(píng)價(jià)具有較高應(yīng)用價(jià)值。

Wnt5a是Wnt蛋白家族成員之一，是一種分泌性蛋白，在細(xì)胞增殖、分化、黏附和遷移中發(fā)揮作用。它不但與胚胎發(fā)育有關(guān)，它的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但在不同腫瘤中，Wnt5a表達(dá)失調(diào)不一致。如在人類胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤中過(guò)表達(dá)，在體外促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，表現(xiàn)出癌基因的活性。而在甲狀腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和血液腫瘤中，Wnt5a表達(dá)下調(diào)或缺失，表現(xiàn)出抑癌基因的活性。綜合已有的研究，導(dǎo)致Wnt5a抑癌和抗癌“兩面性”的原因至少有三方面：1、Wnt信號(hào)是多通路、多受體、多轉(zhuǎn)錄因子的開(kāi)放式途徑，決定了其作用機(jī)制的復(fù)雜性。2、腫瘤存在高度異質(zhì)性，Wnt5a在不同腫瘤或不同組織類型中發(fā)揮不同功能。3、Wnt5a介導(dǎo)的信號(hào)有細(xì)胞特異性，即Wnt5a與不同細(xì)胞表面表達(dá)的不同受體組合，轉(zhuǎn)導(dǎo)不同信號(hào)，發(fā)揮不同生理功能。Wnt5a在腫瘤發(fā)生中的作用和機(jī)理仍不清楚。目前有研究發(fā)現(xiàn)：Wnt5a主要激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用，在發(fā)育的組織、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞中有表達(dá)，可促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞分化發(fā)育。

Wnt5a與白血病的研究報(bào)道不多，發(fā)明人曾以半定量RT-PCR檢測(cè)白血病和治療緩解病例中Wnt5a表達(dá)，其表達(dá)陽(yáng)性率：急性髓細(xì)胞白血病AML和慢性髓細(xì)胞白血病CML為10%（5/50），急性淋巴細(xì)胞白血病ALL和慢性淋巴細(xì)胞白血病CLL為7.7%（1/13），而經(jīng)治療緩解的髓細(xì)胞白血病病例為62.50%，緩解的淋巴細(xì)胞白血病病例為71.4%，正常人為88.9%（24/27）。顯示W(wǎng)nt5a在髓細(xì)胞白血病和淋巴細(xì)胞白血病中均有表達(dá)缺失或下調(diào)，而在治療緩解病例中則表達(dá)恢復(fù)并接近正常人水平。

綜上所述，Wnt5a可作為分子標(biāo)志物應(yīng)用于診斷白血病的新腫瘤標(biāo)志物、評(píng)價(jià)治療效果的良好指標(biāo)、篩選抗腫瘤藥物的良好靶標(biāo)，也是基因治療的新靶點(diǎn)，對(duì)腫瘤防治具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，一種高特異性和靈敏度的Wnt5a抗體是生產(chǎn)臨床診斷試劑所必需的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種能專一性針對(duì)Wnt5a的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法。

本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為：CCTCC?C2013112。

本發(fā)明還提供由上述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的抗Wnt5a的單克隆抗體。

本發(fā)明所述的單克隆抗體可以用于制備檢測(cè)人外周血細(xì)胞系和骨髓中wnt5a的表達(dá)差異的制劑，用于制備檢測(cè)人外周血細(xì)胞系和骨髓中wnt5a的免疫印跡試劑，或用于制備檢測(cè)人體骨髓和血液中白血病變制劑，或用于制備檢測(cè)人白血病的診斷試劑。

本發(fā)明還提供上述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，主要包含步驟：