[發(fā)明專利]TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310514526.7
• 申請(qǐng)日: 2013-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103571953A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳松;黃嫻;王波;蔡志明;梅紅兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 深圳市合道英聯(lián)專利事務(wù)所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果;謝成毅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法。

-背景技術(shù)

膀胱癌是排在第九位的全球最常見(jiàn)的腫瘤。2013年,在美國(guó)有超過(guò)73000名患者被診斷為膀胱癌，其中死亡人數(shù)約15000人。其中超過(guò)90%的患者最初診斷為原發(fā)性膀胱癌，大約75%的患者目前為表淺膀胱腫瘤,20%的為浸潤(rùn)性膀胱腫瘤,剩下的5%初診為轉(zhuǎn)移性腫瘤。先前的研究表明,膀胱癌有著多變的臨床表現(xiàn)和遺傳背景。最近的膀胱腫瘤研究報(bào)道了8個(gè)相關(guān)基因(UTX,MLL-MLL3,CREBBP-EP300,NCOR1,?ARID1A,CHD6)。

目前檢測(cè)“膀胱癌”采用的腫瘤標(biāo)記物主要有以下幾種，但是各腫瘤標(biāo)志物都存在不同的缺點(diǎn)：

(1)、膀胱腫瘤抗原(BTA)：BTA試劑分為BTA?stat和BTA?test兩種；首先，這兩種試劑都不能獨(dú)立用于確診膀胱癌；另外，BTA試劑價(jià)格昂貴，目前尚難以全面推廣使用；

(2)、Lewis?X抗原檢測(cè)：Lewis?X是一種ABO血型相關(guān)抗原，在正常尿路上皮中不存在該抗原；而5%～89%的移行細(xì)胞癌可檢出Lewis?X，但Lewis?X與腫瘤的分級(jí)無(wú)關(guān)；

(3)、核基質(zhì)蛋白22(nuclear?matrix?protein22，NMP22)：NMP22是核有絲分裂器蛋白，診斷膀胱癌的敏感性為48%～90%，特異性為70%～92%，NMP22對(duì)高級(jí)，高期膀胱癌敏感性較高；

(4)、纖維蛋白/纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin?degradation?products，F(xiàn)DP)：用快速免疫檢測(cè)法測(cè)定尿中FDP診斷膀胱癌的敏感性為68%，對(duì)T2～T4期膀胱癌的敏感性更是高達(dá)100%；

(5)、玻璃酸酶檢測(cè)hyaluronidase,HAase：玻璃酸酶是一種細(xì)胞外降解基質(zhì)透明質(zhì)酸的內(nèi)源性糖苷酶，在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，應(yīng)用凝膠技術(shù)檢測(cè)G2，G3級(jí)膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性達(dá)92%～100%；

(6)、端粒酶活性(telomerase)：端粒是位于染色體末端的保護(hù)性結(jié)構(gòu)，隨細(xì)胞分裂逐步縮短，直至細(xì)胞死亡，端粒酶的作用就是延長(zhǎng)端粒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性增強(qiáng)，該法診斷包括低級(jí)，低期腫瘤在內(nèi)的膀胱癌，敏感性可達(dá)91%。

然而，導(dǎo)致膀胱腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)仍未完全闡明，同時(shí)由于這些個(gè)體標(biāo)記的靈敏性較低以至于未被應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，這表明需要新的靈敏性高的生物標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明的試驗(yàn)過(guò)程中，在超過(guò)85%的人類腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT，?TERT通過(guò)Human?Genome?Browser獲取?NCBI發(fā)布版本37的人類基因組序列：Feb.2009(GRCh37/hg19?)；>hg19_ensGene_ENST00000310581_0?range=chr5:1295163-

1296562?5'pad=400?3'pad=0?strand=-?repeatMasking=none)活躍,我們認(rèn)為是一個(gè)人類腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5號(hào)染色體短臂?,?在人類腫瘤中調(diào)節(jié)端粒酶活性。最近人們應(yīng)用全基因組測(cè)序在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變。人們?cè)谝恍┌螂装颖局凶C實(shí)了高頻率的TERT啟動(dòng)子突變。一些研究發(fā)現(xiàn),?具有活性的端粒酶或TERT表達(dá)增加與腫瘤的病理分期以及臨床分期是相關(guān)聯(lián)的。然而,人們還未獲得TERT基因拷貝，TERT的表達(dá)或活性對(duì)膀胱癌的臨床影響仍然是有爭(zhēng)議的。在本發(fā)明中，我們通過(guò)試驗(yàn)得到TERT啟動(dòng)子的高頻突變位點(diǎn)，并進(jìn)行了相關(guān)的體外功能分析試驗(yàn)來(lái)證實(shí)：這些啟動(dòng)子的突變可提高ETRT活性，是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)所在，這些突變對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和預(yù)后具有重要的意義。

本發(fā)明的目的在于公開(kāi)了一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法。

一種TERT啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性序列的檢測(cè)方法，包括下述步驟：

????以包含TERT啟動(dòng)子基因的待測(cè)基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，?PCR擴(kuò)增TERT啟動(dòng)子基因，所述引物對(duì)P為：

????TF：5’CAGCGCTGCCTGAAACTC3’?

????TR：5’GTCCTGCCCCTTCACCTT3’；