[發明專利]miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法

無效

• 申請號: 201310513778.8
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103614338A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 周建維;王雙燕;費菁;趙家耀;李建瓊;王紅亞
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及一種選擇人卵巢癌細胞株SKOV3為親代細胞，利用慢病毒載體制備miR-126轉染的卵巢癌細胞株的培養方法。

背景技術

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，現多數已經處于晚期階段，已廣泛轉移至腹腔、盆腔臟器，手術、化療、放療只是最大限度延長患者的生存時間，就現在的醫療發展水平來說很難徹底治愈。由于卵巢癌惡性程度和復發率均較高，再加上容易發生耐藥，其5年生存率只有20%左右。因此，研究卵巢癌的發生發展機制并找尋其治療的靶點是臨床所迫切需要的。MicroRNA在腫瘤發生過程中起著十分重要的作用，miR-126是microRNA家族中的一員，有大量文獻報導miR-126與肺癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤密切相關，但其在卵巢癌中的表達及作用尚不明確。

我們期望能制備一種miR-126轉染的卵巢癌細胞株，以期觀察miR-126轉染后卵巢癌細胞生物學行為的變化，及其對卵巢癌耐藥的影響，進一步研究miR-126在卵巢癌的發生發展中的作用，尋找卵巢癌臨床治療的有效途徑。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法，轉染質粒序列為：

①LV3-has-miR-126序列（5’to3’）：TCGTACCGTGAGTAATAATGCG，

②LV3-has-miR-126inhibitor序列（5’to3’）：CGCATTATTACTCACGGTACGA，

③LV3NC序列（5’to3’）：TTCTCCGAACGTGTCACGT。

作為本發明的miR-126轉染的卵巢癌細胞株制備方法的改進，依次包括以下步驟：

①、親代細胞培養：

人卵巢粘液性囊腺癌細胞株SKOV3，在37℃，體積比5％CO₂條件下培養于含10%FBS、1%Anti-Anti的DMEM高糖培養液中，然后用含0.25％胰酶和0.02%EDTA的PBS消化、傳代，2～3天傳代1次；

②、miR-126準備轉染：

利用慢病毒技術，取步驟①所得的對數生長期SKOV3細胞，接種于6cm培養皿，每孔細胞數為3×10⁵個，加2ml全培養基培養，24小時后待細胞長至80％～90％融合時，用2ml無血清培養基洗細胞一次，準備轉染；

所述全培養基為：FBS與DMEM高糖培養液按照1:9的體積比混合而得；

所述無血清培養基為：DMEM高糖培養液；

③實驗分組及處理；

轉染miR-126過表達組(SKOV3/LV3-has-miR-126組):

1ml?DMEM高糖培養液+45ul?LV3-has-miR-126慢病毒原液（濃度為1×10⁸個/ml）+1ul5ug/ul?polybrene。

作為本發明的miR-126轉染的卵巢癌細胞株制備方法的進一步改進，步驟③的實驗分組還包括以下組別：

轉染miR-126抑制表達組（SKOV3/LV3-has-miR-126inhibitor組）:

1ml?DMEM高糖培養液+45ul?LV3-has-miR-126inhibitor慢毒原液（濃度為1×10⁸個/ml）+1ul5ug/ul?polybrene；

轉染陰性對照組(SKOV3/LV3NC組)：

1ml?DMEM高糖培養液+45ul?LV3NC慢病毒原液（濃度為1×10⁸個/ml）+1ul5ug/ulpolybrene；

空白對照組(NC)：

1ml?DMEM高糖培養液+45ul培養基+1ul5ug/ul?polybrene。

作為本發明的miR-126轉染的卵巢癌細胞株制備方法的進一步改進，對上述SKOV3/LV3-has-miR-126組、SKOV3/LV3-has-miR-126inhibitor組、SKOV3/LV3NC組、空白對照組分別進行以下操作：

每組中加入步驟2）所得的準備轉染的SKOV3細胞，轉染時的MOI值為15；混合均勻后放入培養箱培養24小時，然后更換成全培養基繼續培養24h后，取出培養皿，直接在倒置熒光顯微鏡下進行觀察、細胞計數并拍照，隨機計數100個細胞，計算有綠色熒光的細胞所占細胞總數的百分比，即為轉染效率。