[發明專利]miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法

無效

• 申請號: 201310513778.8
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103614338A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 周建維;王雙燕;費菁;趙家耀;李建瓊;王紅亞
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法，其特征在于轉染質粒序列為：

①LV3-has-miR-126序列：TCGTACCGTGAGTAATAATGCG，

②LV3-has-miR-126inhibitor序列：CGCATTATTACTCACGGTACGA，

③LV3NC序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT。

2.根據權利要求1所述miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟：

①、親代細胞培養：

人卵巢粘液性囊腺癌細胞株SKOV3，在37℃，體積比5％CO₂條件下培養于含10%FBS、1%Anti-Anti的DMEM高糖培養液中，然后用含0.25％胰酶和0.02%EDTA的PBS消化、傳代，2～3天傳代1次；

②、miR-126準備轉染：

利用慢病毒技術，取步驟①所得的對數生長期SKOV3細胞，接種于6cm培養皿，每孔細胞數為3×10⁵個，加2ml全培養基培養，24小時后待細胞長至80％～90％融合時，用2ml無血清培養基洗細胞一次，準備轉染；

所述全培養基為：FBS與DMEM高糖培養液按照1:9的體積比混合而得；

所述無血清培養基為：DMEM高糖培養液；

③實驗分組及處理；

轉染miR-126過表達組(SKOV3/LV3-has-miR-126組):

1ml?DMEM高糖培養液+45ul?LV3-has-miR-126慢病毒原液（濃度為1×10⁸個/ml）+1ul5ug/ul?polybrene。

3.根據權利要求2所述miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法，其特征在于：

所述步驟③的實驗分組還包括以下組別：

轉染miR-126抑制表達組（SKOV3/LV3-has-miR-126inhibitor組）:

1ml?DMEM高糖培養液+45ul?LV3-has-miR-126inhibitor慢毒原液（濃度為1×10⁸個/ml）+1ul5ug/ul?polybrene；

轉染陰性對照組(SKOV3/LV3NC組)：

1ml?DMEM高糖培養液+45ul?LV3NC慢病毒原液（濃度為1×10⁸個/ml）+1ul5ug/ulpolybrene；

空白對照組(NC)：

1ml?DMEM高糖培養液+45ul培養基+1ul5ug/ul?polybrene。

4.根據權利要求3所述miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法，其特征在于：

對上述SKOV3/LV3-has-miR-126組、SKOV3/LV3-has-miR-126inhibitor組、SKOV3/LV3NC組、空白對照組分別進行以下操作：

每組中加入步驟2）所得的準備轉染的SKOV3細胞，轉染時的MOI值為15；混合均勻后放入培養箱培養24小時，然后更換成全培養基繼續培養24h后，取出培養皿，直接在倒置熒光顯微鏡下進行觀察、細胞計數并拍照，隨機計數100個細胞，計算有綠色熒光的細胞所占細胞總數的百分比，即為轉染效率。

5.根據權利要求2、3或4所述miR-126轉染的卵巢癌細胞株的制備方法，其特征在于：miR-126轉染的卵巢癌細胞株（SKOV3/LV3-has-miR-126組）具有以下特征：

①miR-126轉染的卵巢癌細胞株，狹長的細胞減少，細胞骨架增加，片狀偽足減少，這均有利于抑制腫瘤細胞的遷移；

②miR-126轉染的卵巢癌細胞株S期增殖指數降低；

③侵過基質膠的穿膜細胞數減少。