[發(fā)明專利]一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆及功能表達方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310513641.2
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103555738A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 陳娜;禹山林;楊慶利;遲曉元;潘麗娟;陳明娜;王通;王冕;楊珍
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/26
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆及功能表達方法。

背景技術

花生為豆科落花生屬作物，富含油脂和蛋白，是我國重要的油料作物和經濟作物。花生的產量和品質受干旱、鹽堿等脅迫影響非常嚴重，全國每年因干旱引起的花生減產率達20％以上。但由于花生品種資源遺傳基礎狹窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐鹽的基因源，利用常規(guī)育種方法難以培育出高抗品種。隨著分子生物學的快速發(fā)展，近年來利用轉基因技術提高植物脅迫耐受能力的研究取得了顯著成果，對脅迫相關基因和信號轉導途徑也有了更深入的了解。

牛心果堿氧化酶是催化芐基異喹啉(類)生物堿合成過程中的關鍵酶，催化牛心果堿生成斯氏紫堇堿(Liscombe?and?Facchini,2008)。目前有關該基因功能的研究較少，其在非生物脅迫中的功能研究尚未見報道。本研究通過芯片雜交發(fā)現該基因在花生鹽處理芯片中表達上調明顯，隨后對該基因進行了基因克隆及功能研究。

發(fā)明內容

為了提高花生生長的抗逆境能力，增強其耐鹽、抗旱、耐低溫能力，本發(fā)明提供了一種花生逆境脅迫基因AhROLP1的克隆及功能表達方法。

技術方案

一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

（1）材料的準備與處理：材料選擇花生花育33，花生種子在營養(yǎng)土和蛭石以2：1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22-28℃，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理；

材料的低溫處理，將三葉期花生幼苗置于4℃光照培養(yǎng)箱中進行處理，取處理時間分別為0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生葉片和根作為材料；對于耐鹽用NaCl處理；對于抗旱，用PEG6000處理；將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM?NaCl或重量濃度20%PEG6000溶液中，在處理時間為0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的葉片和根作為材料，所有材料均保存于-80℃超低溫冰箱中備用；

（2）RNA的提取和cDNA的合成

按照試劑盒操作手冊的方法用天根的RNeasy?Mini?Kit分離提取花生幼苗RNA。RQ1?RNase-free?DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進行cDNA的合成。用M-MLVReverseTranscriptase進行cDNA的合成，25-μL反應體系中包含2μgRNA。在42℃條件下經過60min的反轉錄反應后將反轉錄產物置于冰上放置5min，之后將反轉錄產物于-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）基因克隆

通過RT-PCR進行克隆，PCR擴增所用的聚合酶為LA?Taq^TMDNA?polymerase，在25-μL體系中加入以下成分：含MgCl₂的2.5μL?10×PCR?buffer；2.5μL?10mMdNTPs；1μL?cDNA模板；0.5μL?LA?polymerase和17.5μL?ddH₂O。PCR反應條件為：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min。

擴增基因全長所用引物為AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’；

PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒進行純化，純化產物連接pMD18-T?Easy?vector并測序；

本發(fā)明的AhROLP1基因開放閱讀框為1620bp，共編碼540個氨基酸。

本發(fā)明的AhROLP1基因的氨基酸序列在NCBI網站上通過Blast分析后發(fā)現該基因氨基酸序列與鷹嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果堿氧化酶同源性均達到了70%以上。

本發(fā)明的AhROLP1基因的核苷酸序列是序列表中序列1。

本發(fā)明的AhROLP1基因的氨基酸序列是序列表中序列2。

用熒光定量Real-time?RT-PCR對AhROLP1基因逆境下的功能表達進行分析，其方法如下：