[發(fā)明專利]一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆及功能表達(dá)方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310513641.2 | 申請日： | 2013-10-25 |
| 公開（公告）號： | CN103555738A | 公開（公告）日： | 2014-02-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳娜;禹山林;楊慶利;遲曉元;潘麗娟;陳明娜;王通;王冕;楊珍 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東省花生研究所 |
| 主分類號： | C12N15/53 | 分類號： | C12N15/53;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/26 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 266000 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 花生 逆境 脅迫 ahrolp1 基因 克隆 功能 表達(dá) 方法 | ||
1.一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步驟：
（1）材料的準(zhǔn)備與處理：材料選擇花生花育33，花生種子在營養(yǎng)土和蛭石以2：1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22-28℃，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理；
材料的低溫處理，將三葉期花生幼苗置于4℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，取處理時間分別為0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生葉片和根作為材料；對于耐鹽用NaCl處理；對于抗旱，用PEG6000處理；將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mMNaCl或重量濃度20%PEG6000溶液中，在處理時間為0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的葉片和根作為材料，所有材料均保存于-80℃超低溫冰箱中備用；
（2）RNA的提取和cDNA的合成
按照試劑盒操作手冊的方法用天根的RNeasyMiniKit分離提取花生幼苗RNA，RQ1?RNase-free?DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成，用M-MLV?Reverse?Transcriptase進(jìn)行cDNA的合成，25-μL反應(yīng)體系中包含2μgRNA，在42℃條件下經(jīng)過60min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5min，之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
（3）基因克隆
通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LA?TaqTM?DNA?polymerase，在25-μL體系中加入以下成分：含MgCl2的2.5μL?10×PCRbuffer；2.5μL?10mMdNTPs；1μL?cDNA模板；0.5μL?LA?polymerase和17.5μL?ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min；
擴(kuò)增基因全長所用引物為AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’；
PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18-TEasy?vector并測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因開放閱讀框為1620bp，共編碼540個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與鷹嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果堿氧化酶同源性均達(dá)到了70%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的核苷酸序列是序列表中序列1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆及功能表達(dá)方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的任意一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的功能表達(dá)方法，用熒光定量Real-timeRT-PCR對AhROLP1基因逆境下的功能表達(dá)進(jìn)行分析，其方法如下：
熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8ng?μL-1，用的聚合酶是SYBR?Premix?Ex?Taq?polymerase，用的儀器是LightCycler?2.0?instrument?system，每反應(yīng)體系加2μL稀釋的cDNA；
PCR反應(yīng)程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s；PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0.5℃；actin11為實驗的內(nèi)參基因。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于山東省花生研究所，未經(jīng)山東省花生研究所許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201310513641.2/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
