[發(fā)明專利]乳酸糞鏈球菌的發(fā)酵方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310510336.8
• 申請日: 2013-10-26
• 公開（公告）號: CN103540550A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘭亞朝;韓曉平
• 申請（專利權(quán)）人: 蘭亞朝
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/46
• 代理公司: 太原科衛(wèi)專利事務(wù)所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種乳酸糞鏈球菌的發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

乳酸糞鏈球菌屬于腸球菌中的一種，是兼性厭氧的乳酸菌，它不僅是人和動物腸道中常見的正常菌種，還用于改善食品、飼料的質(zhì)量。乳酸糞鏈球菌相對于嚴(yán)格厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌、乳桿菌來說，它是便于生產(chǎn)和使用的首選菌種。1989年美國FDA就公布它為可直接用于動物的菌種之一。大量實驗證明，由乳酸糞鏈球菌組成的益生素可提高幼年畜禽的體增重，改善飼料報酬，減少腹瀉率，降低死亡率。另外，乳酸糞鏈球菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、過氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抑制病原菌和腐敗菌、提高免疫力、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)等生理功效。因此，乳酸糞鏈球菌在畜牧生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用發(fā)展前景。

目前國內(nèi)眾多乳酸糞鏈球菌生產(chǎn)企業(yè)在乳酸糞鏈球菌發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵技術(shù)的限制，造成了乳酸糞鏈球菌菌數(shù)偏低的問題，一般含量在37億/ml以下，大大影響了產(chǎn)品的成本以及質(zhì)量，為此，采取措施提高乳酸糞鏈球菌的活菌率是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有乳酸糞鏈球菌在發(fā)酵過程中存在菌數(shù)偏低的問題，而提供一種乳酸糞鏈球菌的發(fā)酵方法。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種乳酸糞鏈球菌的發(fā)酵方法，包括如下步驟：

1）一、二、三級培養(yǎng)基的配制：按質(zhì)量比為100:6:12:20:20:20分別稱取牛心浸液、氯化鈉、蛋白胨、豬肝浸液、羊肝浸液和葡萄糖，將牛心浸液、氯化鈉、蛋白胨、豬肝浸液和羊肝浸液混合得到混合液A，向混合液A中添加碳酸鈉調(diào)節(jié)混合液A的pH至7.2-7.4，然后將混合液A煮沸過濾后得到濾液A，將葡萄糖添加到濾液A中攪拌均勻得到混合液B，分別取15ml混合液B作為一級培養(yǎng)基、取150ml混合液B作為二級培養(yǎng)基、取800ml混合液B作為三級培養(yǎng)基，其中，一級培養(yǎng)基中添加有質(zhì)量為15ml混合液B質(zhì)量1.5-2%的瓊脂，一、二、三級培養(yǎng)基經(jīng)115℃蒸汽滅菌25min后，再空白培養(yǎng)24h（空白培養(yǎng)是指里面不加任何菌種培養(yǎng)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的），最后置于冰箱保存?zhèn)溆?，冰箱溫度控制?-8℃；

2）一、二、三級種子培養(yǎng)：取乳酸糞鏈球菌作為菌種接入空白斜面試管內(nèi)并在37-39℃下培養(yǎng)18-20h得到斜面菌種，其中，所取的乳酸糞鏈球菌的質(zhì)量與步驟1）中牛心浸液的質(zhì)量比為0.5:100；將得到的斜面菌種接入一級培養(yǎng)基中并在37-39℃下培養(yǎng)18-20h得到一級種子，將一級種子接入二級培養(yǎng)基中并在37-39℃下培養(yǎng)18-20h得到二級種子，將二級種子接入三級培養(yǎng)基中并在37-39℃下培養(yǎng)18-20h得到三級種子；

3）發(fā)酵罐培養(yǎng)液的配制：按質(zhì)量比為9:9:72:20:20:18:72：400:1400分別稱取牛肉膏、氯化鈉、蛋白胨、豬肝浸液、羊肝浸液、碳酸鈣、葡萄糖、純化水A和純化水B；將稱量好的純化水A、牛肉膏、氯化鈉和蛋白胨加入夾層鍋內(nèi)，打開夾層鍋的蒸汽閥，加熱攪拌使其充分溶解，加熱溫度為80-85℃，再將稱量好的豬肝浸液和羊肝浸液加入到夾層鍋內(nèi)，攪拌均勻得到混合液C，通過向混合液C中添加碳酸鈉調(diào)節(jié)混合液C的pH至7.2-7.4，最后過濾混合液C得到濾液B；將濾液B以及稱量好的純化水B、碳酸鈣、葡萄糖加入發(fā)酵罐中攪拌均勻得到培養(yǎng)液A，對培養(yǎng)液A進(jìn)行121℃蒸汽滅菌25min后，放冷至37-40℃；

4）發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液的發(fā)酵：將步驟2）中得到的三級種子加入到發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液A中，三級種子與培養(yǎng)液A的質(zhì)量比為1:580，然后在39-41℃培養(yǎng)16-18h，培養(yǎng)過程中每隔1h開動發(fā)酵罐攪拌一次，每次攪拌10min，等發(fā)酵罐內(nèi)的碳酸鈣完全消失時，發(fā)酵完成即可放罐。

進(jìn)一步地，所述的牛心浸液制備方法如下：取新鮮的牛心，除去脂肪、筋膜及血管，切細(xì)絞碎得到牛心肉末，取牛心肉末并加純化水，純化水的添加量為每3g牛心肉末添加10ml純化水，將添加純化水的牛心肉末置于冰箱中浸漬18h以上，冰箱溫度控制在4-8℃，然后取出水浴加熱至肌肉凝結(jié)成餅狀并浮于液面，水浴加熱溫度控制在98-100℃，浸液呈澄明淡黃色，放冷至室溫，過濾得到的濾液即為所述的牛心浸液；豬肝浸液、羊肝浸液的制備方法與牛心浸液的制備方法相同。

在步驟2）中，作為菌種的乳酸糞鏈球菌是從直接購買或?qū)嶒炇冶４娴娜樗峒S鏈球菌斜面挑去少許菌落劃線于培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)，反復(fù)多次，最后選取平皿上的大菌落，轉(zhuǎn)接到試管斜面內(nèi)并在37-39℃下培養(yǎng)18-20h得到斜面菌種。