[發明專利]一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法

有效

• 申請號: 201310509029.8
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103509876B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 儲昭慶;李鵬
• 申請（專利權）人: 上海辰山植物園
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

本發明公開了一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括：步驟1）酵母目標突變體的獲得；步驟2）多重逆境篩選；步驟3）候選基因測序；步驟4）抗多重逆境檢驗。本發明根據異源功能互補、利用對各種逆境條件均敏感的酵母突變體，快速篩選出植物cDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因。可在短時間內篩選出大量與植物多重逆境抗性相關的基因，且實驗成本低、操作程序簡單、穩定性好、效率高。

技術領域

本發明屬于遺傳工程領域，涉及一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，具體涉及一種根據異源功能互補、利用對各種逆境條件均敏感的酵母突變體，快速篩選出植物cDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因的方法。

背景技術

近年來，由于環境變化加劇，對世界范圍內的作物生長帶來了巨大的影響。據統計，在世界范圍內，適于耕種的土地不足10%，大部分土地處于干旱、高溫、低溫、鹽堿、重金屬等逆境中。而且，因人口的不斷增長對糧食需求的壓力越來越大，迫切需要培育出能在各種非生物脅迫下生長的經濟作物。在植物抗逆性研究中，目的不僅在于從分子水平上解釋植物適應逆境的機制，而且更希望獲得各種抗逆基因，用于作物的抗逆育種。

目前，已獲得了許多與非生物脅迫抗性有關的基因，為植物抗逆性的生物工程提供了可靠的理論依據和實踐基礎。對植物抗逆性的分子機制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且植物生長在自然界中，往往處于多種逆境條件的共同脅迫下，多種非生物脅迫的同時出現對植物來說是最致命的，最有效應對的方法是找出調控逆境組合反應的基因。

目前，分離抗逆基因的方法很多，但或多或少都存在一些不足。如mRNA差異顯示方法，假陽性比例高；cDNA文庫的差示篩選，容易找到表達量高的基因，很難找到低拷貝數、低表達的基因；圖位克隆法，準確率高，但是代價昂貴，操作復雜。最主要的是，這些方法一般僅能得到與某種特定脅迫相關的若干基因，基因數量有限，并且只是針對那些遺傳背景和基因組信息齊全的植物。如果能夠快速篩選出非模式抗逆植物資源中的多重逆境抗性相關的大量基因，將具有非常重要的意義。

酵母作為研究高等真核生物的一種重要的模式生物，不僅在生物信息學方面發揮著重要的作用，其豐富的突變體在其他生物基因克隆和功能驗證等方面也發揮著重要的作用。多重逆境單細胞篩選酵母異源互補方法是利用對各種逆境組合敏感的酵母突變體，來建立異源功能互補篩選平臺，篩選植物體內控制逆境組合的新基因，將在植物抗逆基因的篩選中發揮重要作用，為高等真核生物的基因克隆提供了一種捷徑。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，以克服現有技術的不足，快速篩選出抗H₂O₂、ZnCl₂、CdCl₂、NaCl及耐高溫、耐低溫的植物多重逆境抗性基因，該方法具有成本低、操作程序簡單、篩選效率高、穩定性好等優點。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案來實現。

一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步驟：

步驟1）酵母目標突變體的獲得

將酵母野生型（Saccharomyces cerevisiae）和酵母突變體庫的各種突變體，接種于YPD液體培養基中，30℃過夜培養，轉入新鮮YPD液體培養基，至分裂2代。收集處于對數生長期的細胞（OD₆₀₀=0.4～0.6），10倍梯度稀釋5次，分別置于含0.5-2.0mmol/L H₂O₂、20-80mmol/L ZnCl₂、50-250mmol/L CdCl₂、150-350mmol/L NaCl的YPD固體培養基中培養，及分別在高溫37℃、低溫15℃、正常條件（30℃）下置于YPD固體培養基中培養；從中篩選出對上述逆境條件均敏感的酵母菌株突變體ΔHog1，作為文庫篩選的宿主菌株。