[發明專利]一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法

有效

• 申請號: 201310509029.8
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103509876B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 儲昭慶;李鵬
• 申請（專利權）人: 上海辰山植物園
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

1.一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步驟：

步驟1)酵母目標突變體的獲得

將酵母野生型和各種酵母突變體，接種于YPD液體培養基中，30℃過夜培養，轉入新鮮YPD液體培養基，至分裂2代；收集處于對數生長期的細胞(OD₆₀₀＝0.4～0.6)，10倍梯度稀釋5次，分別置于含0.5-2.0mmol/L H₂O₂、20-80mmol/L ZnCl₂、50-250mmol/L CdCl₂、150-350mmol/L NaCl的YPD固體培養基中培養，及分別在37℃、15℃、30℃條件下置于YPD固體培養基中培養；從中篩選出對上述逆境條件均敏感的酵母菌株突變體ΔHog1，作為文庫篩選的宿主菌株；

步驟2)多重逆境篩選

用植物cDNA文庫轉化步驟1)中篩選出的突變體菌株ΔHog1得到酵母轉化子，并培養于含0.25-1.0mmol/L H₂O₂的營養缺陷型SD培養基上；挑取生長出的單克隆，培養于含0.25-1.0mmol/L H₂O₂的營養缺陷型SD培養基上；將生長狀態良好的酵母轉化子分別培養于含0.25-1.0mmol/L H₂O₂、5-15mmol/L ZnCl₂、20-100mmol/L CdCl₂、100-350mmol/L NaCl的營養缺陷型SD固體培養基上，及分別在37℃、15℃、30℃條件下置于營養缺陷型SD固體培養基中培養；

步驟3)候選基因測序

提取在步驟2)中的逆境條件下都生長良好的酵母轉化子質粒，進行測序，所得植物基因進行抗多重逆性檢驗；

步驟4)抗多重逆性檢驗

選取缺失步驟3)中所得多重逆境抗性基因的植物突變體，與植物野生型同時培養于含1.0-15mmol/L H₂O₂、100-450μmol/L ZnCl₂、50-350mmol/L CdCl₂、50-300mmol/L NaCl、的MS固體培養基及在37℃、15℃、22℃條件下置于MS固體培養基；如果該植物突變體的生長狀態差于植物野生型，則步驟3)測序得到的植物基因即為該植物的多重逆境抗性基因。

2.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述植物為擬南芥。

3.根據權利要求2所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述擬南芥中多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。

4.根據權利要求1或3所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述多重逆境抗性基因是指植物中與抗H₂O₂、ZnCl₂、CdCl₂、NaCl及抗高溫、低溫環境相關的基因。

5.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步驟1)中，YPD固體培養基中加入的H₂O₂、ZnCl₂、CdCl₂、NaCl濃度分別為1.0-1.5mmol/L、30-60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。

6.根據權利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步驟2)中所述營養缺陷型SD培養基的缺失營養成分為亮氨酸。