[發明專利]一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法

有效

• 申請號: 201310507875.6
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103695533A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 李志芳;朱荷琴;馮自力;趙麗紅;師勇強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物病理學領域，具體地，本發明涉及一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法。?

背景技術

棉花是世界性重要的經濟作物和紡織工業原料，也是關系國計民生的重要物資。長期以來，棉花病蟲害的普遍發生始終是制約棉花高產的瓶頸問題，其中最為嚴重的當屬黃萎病和枯萎病，其次為鈴病和苗病，多為真菌病害。為了更加科學制定合理的防控措施，對病害種類的確認是最為必要的前提，因此快速準確鑒定病原菌就顯得尤為重要。?

棉花病原真菌傳統的鑒定是以形態學、細胞學、生理學和生態學等特征為根據的，但是由于很多真菌生物學性狀極其相似，因此，要求科研工作者具有豐富的實踐經驗，同時，傳統的鑒定還較為費時、費力。隨著分子生物學的發展，核糖體內部轉錄間隔區(Internal?transcribed?spacer，ITS)擴增、克隆測序，大大提高了病原真菌鑒定的準確性，但仍存在實驗周期較長，成本較高的問題。完成ITS克隆、測序、比對一系列程序需要大約一周，且一個樣品的鑒定費用大約是40元。?

雖然采用ITS-RFLP方法鑒定病原真菌已經有文獻進行報道，由于棉花病原真菌基因上的相似性，存在嚴重的相互干擾，因此如何針對棉花病原真菌的特點，選擇合適的引物以及內切酶來提高鑒定的準確性仍然是本領域的技術人員亟待解決的技術問題。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，快速而又準確的鑒定棉花病原真菌的種類，為病害的有效防控提供依據。?

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，選擇棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黃萎病、枯萎病、立枯病、紅腐病和紅粉病所對應的病原菌大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、串珠鐮刀菌和粉紅單端孢，并測定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在線分析選擇酶切帶譜類型各異的限制性內切酶HhaI、HaeIII、TaqI、?Sau3A，結合pDRAW32軟件，對酶切產物分布情況進行分析，并繪制出2-4％的瓊脂糖凝膠電子酶切圖譜，作為比對使用的標準圖譜；?

隨后提取待測棉花樣品的病原真菌的基因組DNA，采用如下引物對所提取的DNA進行PCR擴增；?

ITS4：5’-TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC-3’：?

ITS5：5’-GGA?AGT?AAA?AGT?CGT?AAC?AAG?G-3’：?

擴增產物使用限制性內切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分別酶切，并采用與前述瓊脂糖凝膠相同濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將酶切結果和電子標準圖譜比對，鑒定病原真菌種類。?

其特征在于包括下述步驟：?

表1棉花主要病害和病原真菌列表?

在本發明的一個優選實施方式中，所述的鑒定步驟包括如下步驟：?

1)DNA的提取：將分離純化的棉花病原真菌接種至PDA培養基，28℃恒溫靜置培養，收集菌絲，收集棉花病原真菌的菌絲，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH₂O溶解基因組DNA?

2)PCR擴增：以上述病原真菌的基因組DNA為模板，采用引物對ITS4?5’-TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC-3’和ITS5?5’-GGA?AGT?AAA?AGT?CGT?AAC?AAG?G-3’進行PCR擴增。20μl的PCR反應體系：包括10×PCR?buffer(Mg²⁺)2μl，濃度為10mM的dNTP溶液1.6μl，濃度為10uM引物ITS4／ITS5各1μl，基因組DNA1μl，濃度為5U／μl的Taq酶0.2μl，以及13.2μl的ddH₂O。擴增反應程序為：94℃預變性2min，之后，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共25個循環，最后72℃延伸10min，得到ITS的PCR產物，產物大小范圍為500-750bp。?

3)酶切反應：任意使用限制性內切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A對ITS的PCR產物酶切。10μl的酶切體系：ITS模板6μl，10×內切酶buffer1μl，內切酶0.5μl、ddH₂O?2.5μl。反應條件為：PCR儀中37℃保溫1h，加入2μl的6×loading?buffer終止反應，3％瓊脂糖凝膠電泳恒壓75V，2小時，在紫外燈下觀察拍照，獲得ITS-RFLP帶譜；?