[發明專利]一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法

有效

• 申請號: 201310507875.6
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103695533A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 李志芳;朱荷琴;馮自力;趙麗紅;師勇強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，選擇棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黃萎病、枯萎病、立枯病、紅腐病和紅粉病所對應的病原菌大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、串珠鐮刀菌和粉紅單端孢，并測定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在線分析選擇酶切帶譜類型各異的限制性內切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A，結合pDRAW32軟件，對酶切產物分布情況進行分析，并繪制出2-4％的瓊脂糖凝膠電子酶切圖譜，作為比對使用的標準圖譜；

隨后提取待測棉花樣品的病原真菌的基因組DNA，采用如下引物對所提取的DNA進行PCR擴增；

ITS4：5’-TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC-3’：

ITS5：5’-GGA?AGT?AAA?AGT?CGT?AAC?AAG?G-3’：

擴增產物使用限制性內切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分別酶切，并采用與前述瓊脂糖凝膠相同濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將酶切結果和電子標準圖譜比對，鑒定病原真菌種類。

2.根據權利要求1所述的快速鑒定方法，其特征在于所述的鑒定方法包括如下步驟：

1)DNA的提取：將分離純化的棉花病原真菌接種至PDA培養基，28℃恒溫靜置培養，收集菌絲，收集棉花病原真菌的菌絲，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH₂O溶解基因組DNA；

2)PCR擴增：以上述病原真菌的基因組DNA為模板，采用引物對ITS4?5’-TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC-3’和ITS5?5’-GGA?AGT?AAA?AGT?CGT?AAC?AAG?G-3’進行PCR擴增；20μl的PCR反應體系：包括10×PCR?buffer(Mg²⁺)2μl，濃度為10mM的dNTP溶液1.6μl，濃度為10uM引物ITS4／ITS5各1μl，基因組DNA1μl，濃度為5U／μl的Taq酶0.2μl，以及13.2μl的ddH₂O；擴增反應程序為：94℃預變性2min，之后，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共25個循環，最后72℃延伸10min，得到ITS的PCR產物，產物大小為500-750bp；

3)酶切反應：任意使用限制性內切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A對ITS的PCR產物酶切；10μl的酶切體系：ITS模板6μl，10×內切酶buffer1μl，內切酶0.5μl、ddH₂O2.5μl；反應條件為：PCR儀中37℃保溫1h，加入2μl的6×loading?buffer終止反應，3％瓊脂糖凝膠電泳恒壓75V，2小時，在紫外燈下觀察拍照，獲得ITS-RFLP帶譜；

4)帶譜鑒別：將上述獲得的ITS-RFLP帶譜和標準電子酶切圖譜比對，首先比對HhaI和Sau3A對應的大小和電子圖譜。