[發明專利]一種嗜熱的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法

無效

• 申請號: 201310507511.8
• 申請日: 2013-10-25
• 公開（公告）號: CN103865833A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 程池;趙紀文;姚粟;信春暉;李輝;劉勇;張明娟
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院;山東扳倒井股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12G3/02;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法及其特性，具體涉及到該枯草芽孢桿菌菌劑的高溫耐受性和產蛋白酶活力。?

背景技術

枯草芽孢桿菌是芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中的重要功能微生物。分離于芝麻香型白酒發酵的高溫大曲的枯草芽孢桿菌CGMCC?8087?(=?CICC?15073)?能夠耐受較高的溫度?(55℃生長良好，而一般的枯草芽孢桿菌55℃不能生長)，能夠產生較高的水解活力中性蛋白酶。在高溫制曲等發酵過程中，該菌產生的嗜熱蛋白酶能夠降解蛋白質產生游離的氨基酸，為白酒釀造等發酵過程提供重要的前體物質。因此，通過逐級培養制備的枯草芽孢桿菌菌劑非常適合芝麻香型白酒的高溫發酵過程，在芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中具有很高潛在的使用價值。?

發明內容

本發明的目的在于：提供了一種嗜熱的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，該菌劑能夠耐受較高溫度，并且較高的蛋白酶水解活力的能力。通過斜面種子活化，一級種子液培養，二級擴大再培養以及真空冷凍干燥制備得到了該枯草芽孢桿菌菌劑，非常適合芝麻香型白酒的高溫發酵過程，在芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中具有很高潛在的使用價值。?

本發明的技術解決方案是該枯草芽孢桿菌菌劑的制備。?

1）枯草芽孢桿菌枯草亞種Bacillus?subtilis?subsp.?subtilis菌株：2013年8月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號），編號為CGMCC?8087?(=?CICC?15073)?（產耐熱蛋白酶），其16S?rDNA序列的Genebank登錄號為KF742413；該菌菌落為乳白色，圓形，表面粗糙，邊緣整齊，不透明，較粘稠，易挑取。菌落大小為（0.3-0.4）cm×（0.3-0.4）cm，菌落生長迅速。顯微鏡下觀察，菌體呈長桿狀，單個居多，有少數兩連桿、三連桿、鏈狀現象。該菌的生長溫度范圍為25-55℃（一般的枯草芽孢桿菌55℃不能生長）。?

2）斜面種子的制備：將枯草芽孢桿菌CGMCC?8087?(=?CICC?15073)接種于營養瓊脂斜面培養基中，在50℃下培養24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養基成分：蛋白胨?10.0克，牛肉粉?3.0克，氯化鈉?5.0克，葡萄糖?1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH?7.0；?

3）一級種子液的制備：取一環試管斜面種子轉接到到液體營養肉湯培養基，在220轉/分鐘，50℃條件下培養24小時進行一級種子液的制備，得一級培養液；其中，所用的培養基成分：蛋白胨?10.0克，牛肉粉?3.0克，氯化鈉?5.0克，葡萄糖?1.0克，蒸餾水1000?毫升，pH?7.0；

4）二級培養液的制備：將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養基中（含水量為50%），在220轉/分鐘，45-55℃條件下發酵培養24小時進行二級培養液的制備。

5）菌劑的制備：收集二級培養得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥（12%脫脂牛奶作為保護劑）制備得到芽孢桿菌菌劑。?

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具體實施方式

實施例1：依以下步驟制備枯草芽孢桿菌CGMCC?8087?(=?CICC?15073)菌劑?

1）斜面種子的制備：將枯草芽孢桿菌CGMCC?8087?(=?CICC?15073)接種于營養瓊脂斜面培養基中，在50℃下培養24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養基成分：蛋白胨?10.0克，牛肉粉?3.0克，氯化鈉?5.0克，葡萄糖?1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH?7.0；

2）一級種子液的制備：取一環試管斜面種子轉接到到液體營養肉湯培養基，在220轉/分鐘，50℃條件下培養24小時進行一級種子液的制備，得一級培養液；其中，所用的培養基成分：蛋白胨?10.0克，牛肉粉?3.0克，氯化鈉?5.0克，葡萄糖?1.0克，蒸餾水1000?毫升，pH?7.0；

3）二級培養液的制備：將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養基中（含水量為50%），在220轉/分鐘，45℃條件下發酵培養24小時進行二級培養液的制備。

4）菌劑的制備：收集二級培養得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥（12%脫脂牛奶作為保護劑）制備得到芽孢桿菌菌劑。?

實施例2：依以下步驟制備枯草芽孢桿菌CGMCC?8087?(=?CICC?15073)菌劑?