[發明專利]檢測花生過敏原用擴增內標、其構建方法及其應用

無效

• 申請號: 201310505536.4
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103589790A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 蔡琴;陳沁;張文舉;關瀟;鄧志瑞
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及一種檢測花生過敏原用擴增內標、其構建方法及其應用。

背景技術

由于食品成分及其加工的復雜性，在DNA提取中殘留的某些雜質成分對PCR擴增可能產生抑制作用，除抑制劑以外，其他原因主要有PCR儀故障、PCR檢測體系不恰當、DNA聚合酶失活以及人為操作失誤等，可能導致PCR檢測出現假陰性結果，這會使得花生過敏患者誤食含有花生成分的食品，造成食品安全問題，危害公眾健康，因而需要絕對避免。在PCR反應體系中加入擴增內標（internal?amplification?control，IAC）是指示假陰性結果的有效手段之一，近年來已經成為PCR檢測標準化的趨勢。

擴增內標（Internal?Amplification?Control，IAC）是添加到PCR反應體系中用以指示假陰性現象的一段人工構建的DNA序列。其作用原理是：將擴增內標添加到PCR反應體系中，使之與目標基因序列共同進行擴增，如果在反應體系中存在一些抑制因素，則擴增內標和目的序列的擴增反應都將受到抑制，從而達到指示PCR反應假陰性的目的。從擴增內標與目的序列在擴增時是否存在競爭性的角度，擴增內標可分為兩類：競爭性擴增內標與非競爭性擴增內標。競爭性擴增內標是指在同一PCR反應體系中與目的基因序列共用同一對引物進行擴增反應的一段基因序列。非競爭性擴增內標則是指在PCR擴增反應中不與目的基因序列共用同一對引物的一段序列。用競爭性擴增內標可以避免在同一PCR檢測體系中使用多對引物，進而可以避免引物間的相互作用。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種檢測花生過敏原用擴增內標。

本發明的目的之二在于提供該擴增內標的構建方法。

本發明的目的之三在于提供使用該擴增內標在檢測花生過敏原中的應用。

假陰性是指由于PCR反應體系中存在抑制因素及其他相關原因致使原來應該為陽性的結果卻呈現陰性的現象。擴增內標（Internal?Amplification?Control，IAC）是添加到PCR反應體系中用以指示假陰性現象的一段人工構建的DNA序列。在PCR反應體系中加入擴增內標是指示假陰性結果的有效手段之一，因為將擴增內標添加到PCR反應體系中，使之與目標基因序列共同進行擴增，如果在反應體系中存在一些抑制因素，則擴增內標和目的序列的擴增反應都將受到抑制，從而達到指示PCR反應假陰性的目的。實驗結果表明，通過復合引物技術構建擴增內標，以及確定擴增內標在PCR體系中的添加量，可以檢測食品中的花生成分。本發明在上述基礎上完成。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測花生過敏原用擴增內標，其特征在于該擴增內標基因的序列為SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列。

一種構建上述的檢測花生過敏原用擴增內標的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.?通過BLAST比對，選擇與花生過敏原Ara?h?1基因同源性較低的單增李斯特菌FSL?R2-561基因（NC_017546）作為內參基因，根據內參基因的序列設計引物，選擇擴增產物比目的片段大150bp?~?250bp的引物FSL-F/R；所述的花生過敏原Ara?h?1的基因為：

Ara?h?1-F：CTGGAAACCTTGAACTCGT，

Ara?h?1-R：GTTGATGGCTACTGGATGA；

所述的內參基因FSL?R2-561的引物序列為：

FSL-F：TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC，

FSL-R：CATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCA；

b.?選取步驟a所得的內參基因的引物FSL-F/R的5’末端的8個堿基與花生過敏原引物Ara?h1-F/R的3’末端相連，得到27bp的長引物IAC-F/R，該長引物的序列為：

IAC-F：CTGGAAACCTTGAACTCGTTAGCCAAC，

IAC-R：GTTGATGGCTACTGGATGACATCATTT；

c.?以步驟a所得內參基因FSL?R2-561基因為模板，以步驟a所得FSL-F/R為引物，進行PCR擴增，得到351bp的PCR產物；以該PCR產物為模板，步驟b所得長引物IAC-F/R為引物，進行PCR擴增，得到389bp的PCR產物即IAC片段；