[發明專利]一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列及其克隆方法

無效

• 申請號: 201310505243.6
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103497957A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 李晚忱;于好強;付鳳玲;劉艷萍;雍太明
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列及其克隆方法。?

背景技術

矮沙冬青（Ammopiptanthus?nanus?Cheng?f.）又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黃花木，屬于豆科沙冬青屬，是第三紀古地中海消失后殘遺在塔里木盆地邊緣荒漠的超旱生常綠闊葉灌木，間斷性分布于西天山與昆侖山的結合部。由于自然歷史原因和人類經濟活動的影響，特別是過度放牧及樵采，矮沙冬青種群衰退嚴重，被列為國家一級瀕危保護植物，其分布區內氣候干旱，降水量遠小于蒸發量，年平均氣溫6.8℃，氣溫變化極值可達70℃以上。沙冬青具有很強的抗逆性，在相對瘠薄的土壤條件下仍能在高達70℃左右的地表沙溫和低至零下20℃~30℃的環境中正常生長發育。有很強的抗寒、抗旱和耐鹽堿等抗逆特性。國內外關于沙冬青屬植物的報道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱機理及相關的超微結構；染色體數目及核型、減數分裂期染色體行為、開花物候、和引種栽培試驗等。這些研究都證實了沙冬青具有抗旱耐凍的特性，因此它是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源。?

甜菜堿醛脫氫酶是催化合成甜菜堿的關鍵酶之一，其催化合成產物（甜菜堿）是植物體內重要的滲透調節物質，對細胞滲透勢的調節、生物大分子的穩定具有重要作用。甜菜堿醛脫氫酶基因的表達能顯著提高植物耐鹽能力；此外，還可以增強植物對干旱脅迫的耐受力。屬于優良的抗逆基因資源，在植物抗逆基因工程中廣泛利用。?

矮沙冬青作為優秀的抗逆植物，克隆上述抗逆基因對基礎和應用研究具有重要意義。?

發明內容

本發明的主要目的就是針對荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因開發研究的局限性，提供一種來源于植物矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，以期應用于其它轉基因作物中使之具有相應的優良的抗逆性能。?

本發明的另一個目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。?

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：?

一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，該序列具有如SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列。

該基因對應的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所述。?

上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物矮沙冬青葉片中提取總RNA、設計引物、進行PCR擴增、測序等克隆得到。?

（1）總RNA的提取和純化：?

可采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA。

常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法、及各種改進方法等，均可用于矮沙冬青葉片總RNA的提取；本發明中可優選試劑盒法（北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNA_OUT2.0提取試劑盒，CAT#90404-50），進行矮沙冬青葉片總RNA提取。?

純化主要是為了去除總RNA中的DNA污染，獲得純化的矮沙冬青葉片總RNA，以滿足后續對目的基因的表達進行定量檢測等需要。常用的RNA純化方法包括：DNA酶消化法(簡稱?D法)、酸酚變性法(簡稱S法)、EDTA法(簡稱?E法)等；本發明中可優選DNA酶（北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNA_OUT2.0提取試劑盒，CAT#90404-50）消化法。?

（2）中間片段的克隆：?

A、中間片段cDNA第一鏈的合成

以上述步驟（1）純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3′-Full?RACE?Core?Set?Ver.2.0（Code：D314）試劑盒中3′?RACE?Adaptor進行反轉錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板。

B、PCR擴增?

以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上游引物（jf）和下游引物（jx），進行PCR擴增：

jf:?5′-CTGTGAATGGCGACACGGAAG?-3′，

jx:?5′-GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3′；

擴增得到矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。

本步驟中，擴增體系可優選為：?

TaqPlusPCR?Master?Mix???????????20?μL?，

cDNA模板?????????????????????????????????2?μL?，