[發(fā)明專利]一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列及其克隆方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310505243.6
• 申請日: 2013-10-24
• 公開（公告）號: CN103497957A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設計）人: 李晚忱;于好強;付鳳玲;劉艷萍;雍太明
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，該序列具有如SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列。

2.根據(jù)權利要求1所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列對應的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所述。

3.一種權利要求1所述的來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟：

（1）總RNA的提取和純化：

可采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA；

（2）中間片段的克隆：

A、中間片段cDNA第一鏈的合成

以上述步驟（1）純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3′-Full?RACE?Core?Set?Ver.2.0（Code：D314）試劑盒中3′?RACE?Adaptor進行反轉錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板；

B、PCR擴增

以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上游引物jf和下游引物jx，進行PCR擴增：

jf:?5′-CTGTGAATGGCGACACGGAAG?-3′，

jx:?5′-GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3′；

擴增得到矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列；

（3）3′端的克隆：

C、3′-outer?PCR擴增

根據(jù)上述步驟（2）得到的中間片段序列，設計并合成特異性上游引物GSP-3′-outer，以前述步驟（2）A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP-3′-outer和TaKaRa公司3′-Full?RACE?Core?Set?Ver.2.0（Code：D314）試劑盒中3′端下游引物3′-RACE?outer，進行3′端outer?PCR擴增：

GSP-3′-outer:?5′-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3′；

3′-RACE?outer:?5′-?TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT?-3′；

擴增得到的產(chǎn)物為cDNA?3′端outer?PCR產(chǎn)物；

D、3′-inner?PCR擴增

根據(jù)前述步驟（2）所得中間片段端序列，設計并合成特異性上游引物GSP-3′-inner，以前述步驟C所得3′端的outer?PCR產(chǎn)物模板，利用特異性上游引物GSP-3′-inner和TaKaRa公司3′-Full?RACE?Core?Set?Ver.2.0（Code：D314）試劑盒中3′端下游引物3′-RACE?inner，進行3′端inner?PCR擴增：

GSP-3′-?inner:?5′-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3′；

3′-RACE?inner:?5′-?CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG?-3′；

擴增得到的產(chǎn)物為cDNA?3′端inner?PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到3′端完整序列；

（4）5′端的克隆：

E、合成5′端的cDNA第一鏈：

以上述步驟（1）純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，經(jīng)過Ambion公司FirstChoice??RLM-RACE?Kit，SKU?#：AM1700試劑盒對RNA處理，加入下述5′?RACE?Adapter后，以Random?Decamers進行反轉錄：

5′?RACE??Adapter：5′-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA?-3′；

合成得到反轉錄產(chǎn)物5′端的cDNA第一鏈；

F、5′-outer?PCR擴增

根據(jù)上述步驟（2）得到的中間片段序列，設計并合成特異性下游引物GSP-5′-outer，以前述步驟E所得反轉錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP-5′-outer和FirstChoice??RLM-RACE?Kit試劑盒中的5′端上游引物5′-RACE?outer，進行5′端outer?PCR擴增：

GSP-5′-outer:?5′-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3′；

5′-RACE?outer:?5′-?GCTGATGGCGATGAATGAACACTG?-3′；

擴增得到的產(chǎn)物為cDNA?5′端outer?PCR產(chǎn)物；

G、5′-inner?PCR擴增

根據(jù)前述步驟（2）所得中間片段序列，設計并合成特異性下游引物GSP-5′-inner，以前述步驟F所得5′端的outer?PCR產(chǎn)物模板，利用特異性下游引物GSP-5′-inner和FirstChoice??RLM-RACE?Kit試劑盒中5′端上游引物5′-RACE?inner，進行5′端inner?PCR擴增：

GSP-5′-?inner:?5′-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3′；

5′-RACE?inner:?5′-?CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG?-3′；

擴增得到的產(chǎn)物為cDNA?5′端inner?PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到5′端完整序列；

（5）全長序列拼接和ORF克隆：

將上述步驟（2）所得中間片段、步驟（3）所得3′端inner?PCR擴增序列和述步驟（4）所得5′端inner?PCR擴增序列進行拼接，cDNA全長作為ORF（Open?Reading?Frame）擴增的cDNA模板；

?以下述上游引物ORF-S和下游引物ORF-A，并進行PCR擴增：

ORF-S:?5′-GTGGATCC(BamH????????????????????????????????????????????????)ATGGCAACCCCAATACCGAAT

ORF-A:?5′-CATCAAGCTT(HindⅢ)CCTATCACAGCTTTGAAGGAGACTG

擴增得到的產(chǎn)物為完整的矮沙冬青甜菜堿醛脫氫酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。