[發(fā)明專利]含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒、含該表達(dá)盒的微環(huán)DNA及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310503003.2
• 申請(qǐng)日: 2013-10-23
• 公開（公告）號(hào): CN104561069A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳志英;馬飛;何成宜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院;深圳市合一康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00;C07K19/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，和一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，一種具有含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的宿主細(xì)胞及其應(yīng)用，以及一種重組嵌合抗原受體及其表達(dá)方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

臨床上，重組嵌合抗原受體已被用來治療各種疾病，包括癌癥和自身免疫性疾病等。但是目前重組嵌合抗原受體一般是在體外生產(chǎn)后再注射到體內(nèi)進(jìn)行治療，這種方式有多種缺點(diǎn)，比如：（1）生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸、保存等環(huán)節(jié)花費(fèi)大、成本高；（2）蛋白抗體藥物純度不高，污染物存在副作用，有安全隱患；（3）抗體的半衰期短，需反復(fù)注射，有時(shí)還需要用微泵給藥法維持體內(nèi)抗體的有效濃度，加大了抗體臨床應(yīng)用的難度，且治療費(fèi)用高昂。?

基因治療采用基因轉(zhuǎn)染的方式將治療性基因轉(zhuǎn)染到人體靶細(xì)胞，是避免直接注射蛋白抗體藥物存在的問題的有效途徑之一。在基因治療中，采用有效的載體高效、安全地將目的基因轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)非常重要，基因治療載體有重組腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和質(zhì)粒載體。其中，病毒載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染率高，但制備病毒載體的費(fèi)用高昂，且病毒載體存在插入突變的風(fēng)險(xiǎn)和免疫原性，會(huì)帶來誘癌風(fēng)險(xiǎn)并可能引發(fā)患者致命的免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體比病毒載體安全，但比病毒載體的轉(zhuǎn)染率低，且外源基因只能瞬時(shí)表達(dá)，如要穩(wěn)定?持久地表達(dá)，載體必須整合到宿主細(xì)胞染色體上，而載體的隨機(jī)整合會(huì)引起插入突變或?qū)е峦庠椿虻某聊送猓瑐鹘y(tǒng)質(zhì)粒載體中含有細(xì)菌復(fù)制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隱藏的表達(dá)信號(hào)，這些序列在質(zhì)粒復(fù)制時(shí)是必需的，但在基因治療中可能引起嚴(yán)重的生物安全性問題。?

發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例第一方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，該微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒能在宿主菌內(nèi)完成微環(huán)DNA的重組過程，消除原核質(zhì)粒元件。?

本發(fā)明實(shí)施例第二方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的構(gòu)建方法。?

本發(fā)明實(shí)施例第三方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，該微環(huán)DNA可游離于宿主細(xì)胞基因組DNA之外穩(wěn)定持久的表達(dá)重組嵌合抗原受體基因。?

本發(fā)明實(shí)施例第四方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的構(gòu)建方法。?

本發(fā)明實(shí)施例第五方面提供了一種具有含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的宿主細(xì)胞。?

本發(fā)明實(shí)施例第六方面提供了一種重組嵌合抗原受體。?

本發(fā)明實(shí)施例第七方面提供了一種重組嵌合抗原受體的表達(dá)方法。?

本發(fā)明實(shí)施例第八方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒、含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA、具有含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的宿主細(xì)胞和重組嵌合抗原受體的應(yīng)用。?

第一方面，本發(fā)明提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，所述微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒是在微環(huán)DNA空質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（MCS）中插入重組嵌合抗原受體基因表達(dá)盒的基因序列組合而成，其中，所述微環(huán)DNA空質(zhì)粒為p2ФC31質(zhì)粒或pMC.BESPX質(zhì)粒，所述重組嵌合抗原受?體基因表達(dá)盒包括依次連接的啟動(dòng)子、重組嵌合抗原受體基因、終止密碼子和polyA加尾信號(hào)。?

優(yōu)選地，所述重組嵌合抗原受體基因具有編碼重組嵌合抗原受體的核苷酸序列，所述重組嵌合抗原受體包括胞外抗原識(shí)別亞單位、穿膜連接亞單位和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位，其中，所述胞外抗原識(shí)別亞單位具有腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)和鉸鏈區(qū)，所述穿膜連接亞單位為胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的跨膜區(qū)或I型跨膜蛋白的跨膜區(qū)，所述胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位具有活化免疫效應(yīng)細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)；?

所述重組嵌合抗原受體的氨基酸序列連接形式依次為：?

腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)–鉸鏈區(qū)–胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的跨膜區(qū)或I型跨膜蛋白的跨膜區(qū)–活化免疫效應(yīng)細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。?

其中，所述重組嵌合抗原受體為膜受體分子，其腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)通過鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)依次相連；所述腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)具有結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原表位的能力，所述鉸鏈區(qū)能讓該膜受體分子的胞外區(qū)，即腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)充分伸展，保持其肽段的功能完整性，從而充分行使識(shí)別、結(jié)合腫瘤抗原的功能；所述跨膜區(qū)為連接膜受體分子的胞外抗原識(shí)別亞單位和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位的肽段；所述胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位的肽段具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活基序。?