[發明專利]含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒、含該表達盒的微環DNA及應用

在審

• 申請號: 201310503003.2
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN104561069A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 陳志英;馬飛;何成宜
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院;深圳市合一康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00;C07K19/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

1.一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述微環DNA重組母質粒是在微環DNA空質粒的多克隆位點中插入重組嵌合抗原受體基因表達盒的基因序列組合而成，其中，所述微環DNA空質粒為p2ФC31質粒或pMC.BESPX質粒，所述重組嵌合抗原受體基因表達盒包括依次連接的啟動子、重組嵌合抗原受體基因、終止密碼子和polyA加尾信號。

2.如權利要求1所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述重組嵌合抗原受體基因具有編碼重組嵌合抗原受體的核苷酸序列，所述重組嵌合抗原受體包括胞外抗原識別亞單位、穿膜連接亞單位和胞內信號轉導亞單位，其中，所述胞外抗原識別亞單位具有腫瘤細胞抗原表位的結合位點和鉸鏈區，所述穿膜連接亞單位為胞內信號轉導蛋白的跨膜區或I型跨膜蛋白的跨膜區，所述胞內信號轉導亞單位具有活化免疫效應細胞的胞內信號轉導區；

所述重組嵌合抗原受體的氨基酸序列連接形式依次為：

腫瘤細胞抗原表位的結合位點–鉸鏈區–胞內信號轉導蛋白的跨膜區或I型跨膜蛋白的跨膜區–活化免疫效應細胞的胞內信號轉導區。

3.如權利要求2所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述腫瘤細胞抗原表位的結合位點為單克隆抗體的單鏈可變區scFv，所述鉸鏈區為CD8α鏈的鉸鏈區，所述I型跨膜蛋白的跨膜區為CD4、CD28或CD8的α鏈，所述胞內信號轉導蛋白的跨膜區為IgG的重鏈，所述活化免疫效應細胞的胞內信號轉導區依次包括第二轉導信號和第一轉導信號。

4.如權利要求3所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述單克隆抗體的單鏈可變區scFv為抗CD19分子單鏈抗體，所述第一轉導信號為免疫球蛋白FcεRI受體的γ鏈和CD3的ζ鏈中的至少一種，所述第二轉導信號為CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的兩種。

5.如權利要求4所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述抗CD19分子單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述第二轉導信號依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；所述第一轉導信號為CD3的ζ鏈，所述CD3的ζ鏈的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。

6.如權利要求3所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述CD8α鏈的鉸鏈區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:5所示；所述CD8的α鏈的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:6所示。

7.如權利要求2所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述免疫效應細胞選自T淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞中的一種。

8.如權利要求2所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述腫瘤細胞選自B淋巴細胞腫瘤細胞、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結直腸癌細胞、肝癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞、膀胱癌細胞和甲狀腺癌細胞中的一種。

9.如權利要求2所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述胞外抗原識別亞單位靶向結合所述腫瘤細胞的至少一個抗原表位。

10.如權利要求1所述的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，其特征在于，所述啟動子和所述重組嵌合抗原受體基因之間連接有編碼CD8信號肽的核苷酸序列，所述編碼CD8信號肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:7所示。