[發明專利]高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應用

有效

• 申請號: 201310501221.2
• 申請日: 2013-10-22
• 公開（公告）號: CN103773729B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發明（設計）人: 王勇;熊智強;李詩淵;汪建峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P1/04;C12P5/02;C12P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 祝蓮君,劉真真

技術領域

本發明屬于合成生物學及工業生物學技術領域，具體地，本發明涉及一種高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應用。

背景技術

合成生物學是基于理性的設計，將標準化的生物元件進行集成與裝配，從而構建性能優良的人造生命系統。合成生物學一經誕生，它的思想和設計就深刻地影響著工業微生物技術的發展，使微生物技術在藥物，生物燃料，精細化學品的開發與生產過程中發揮出更加巨大的作用。

美國加州大學伯克利分校的Keasling實驗室，將黃花蒿來源的紫槐二烯合成酶基因(ads)，紫槐二烯氧化酶基因(cyp71av1)以及細胞色素P450還原蛋白基因(cpr)置于酵母細胞調控元件下，最終在酵母工程菌中組裝了一條青蒿酸的異源合成途徑并成功地合成了青蒿酸。隨后，麻省理工學院和塔夫茨大學的合作者在大腸桿菌中重建了紫杉醇前體-紫杉二烯的合成途徑，結合對工程菌株的一系列改造，最終使得紫杉二烯的產量超過了1g/L。這些研究表明結合合成生物學的設計以及成熟的微生物基因工程技術，可以打破了種屬的界限，實現各種來源珍稀化合物在通用微生物底盤細胞中的高效合成。

萜類化合物是種類最多，結構最豐富，功能最多樣的天然產物，是藥物，芳香物質，食品添加劑，橡膠以及生物燃料的重要來源。目前已被發現的萜類化合物超過40,000種，它們廣泛地存在于植物中，同時真菌和細菌中也有越來越多的萜類化合物被報道。萜類化合物由通用的異戊酰焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)前體單元(C5)通過次序疊加合成。根據疊加的前體單元數量不同，分為半萜(C5)，單萜(C10)，倍半萜(C15)，二萜(C20)，三萜(C20)，四萜(C40)，多萜類化合物及其他萜類生物堿化合物等。越來越多的萜類化合物被發現具有治療和防控多種疾病的功能，比如抗癌，抗微生物，抗真菌，抗寄生蟲，抗病毒，抗炎，免疫調節等。但這些化合物在原產植株或微生物中的合成往往受到嚴格的調控，含量低，且具有明顯的季節性，嚴重地制約了進一步的開發利用。以太平洋紅豆杉來源的紫杉醇為例，作為有效的抗藥藥物，該化合物非常微量地分布在太平洋紅豆杉的樹皮中，1200kg的樹皮只能提取10g純的紫杉醇。

在傳統的模式微生物中，大腸桿菌是一種常用的異源合成底盤細胞。它具有清晰的遺傳背景、成熟的基因操作技術與工具、豐富的基因表達元件，可靠經濟的大規模發酵技術。大腸桿菌采用2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前體途徑合成IPP/DMAPP前體單元，但原始大腸桿菌細胞的MEP途徑只有極低的表達水平，僅能維持很低的前體供應，無法滿足萜類化合物的高效合成。Yuan等人用染色體工程的方法，采用T5啟動子替換MEP途徑相關基因的原始啟動子，以逐個強化MEP途徑基因，并鑒定了途徑中的1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)，4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇合成酶基因(ispD)，2-甲基赤蘚糖醇-2，4-環焦磷酸合成酶基因(ispF)，異戊烯焦磷酸異構酶基因(idi)是限速步驟，共同強化這四個基因的表達，能夠有效改善番茄紅素的合成?；赮uan等研究結果，MIT的研究人員將大腸桿菌內源dxs，ispD，ispF，idi基因串聯成一個操縱子，并結合啟動子工程，基因拷貝數調節等手段，最終獲得工程菌經補料分批發酵后獲得了>1g/L的紫杉二烯。這一系列對MEP途徑的改造，雖取得了很大的成功，但是獲得的底盤細胞仍無法滿足萜類化合物大規模生產的要求。而且針對大腸桿菌內源MEP途徑調控機制及酶學特性仍缺乏足夠的了解，僅僅依賴某些限速步驟基因表達的強化無法徹底地解除途徑中可能存在的未知調控，因此也就無法完全打開MEP途徑的代謝通量并實現更高產萜類化合物底盤細胞的構建。

因此，本領域目前還沒有一種有效的可靠的合成生物學與工業微生物技術，大規模生產萜類化合物。因此迫切需要構建能夠異源合成萜類化合物的重組微生物工程菌，從而實現廉價，全天候，大規模生產萜類化合物。

發明內容

本發明的目的就是提供一種高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應用。

在本發明的第一方面，提供了一種底盤細胞，所述的底盤細胞含有提高所述底盤細胞生產萜類化合物能力的基因。

在另一優選例中，所述的底盤細胞是用于生產萜類化合物的底盤細胞，并且所述的基因是選自下述的至少一個基因或其組合：

來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs2、idi、dxr、或ispD基因；