[發明專利]一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法無效
申請號: | 201310500511.5 | 申請日: | 2013-10-22 |
公開(公告)號: | CN103555684A | 公開(公告)日: | 2014-02-05 |
發明(設計)人: | 樊明濤;朱明明;王樹林 | 申請(專利權)人: | 西北農林科技大學 |
主分類號: | C12N9/08 | 分類號: | C12N9/08;C12N9/02;C12R1/44 |
代理公司: | 西安恒泰知識產權代理事務所 61216 | 代理人: | 李鄭建 |
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摘要: | |||
搜索關鍵詞: | 一種 胡蘿卜素 降解 純化 方法 | ||
技術領域
本發明屬于食品生物技術領域,涉及一種化合物的純化方法,特別涉及一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法。?
背景技術
香氣是各類食品的重要特征之一,香氣的種類、含量是衡量食品質量的重要依據,在很大程度上決定人們對食品的喜好。降異戊二烯化合物廣泛存在于果酒、水果及煙草中,是對食品香氣品質具有重要影響的化合物。降異戊二烯香氣化合物一般含有13個碳原子,這一類香氣化合物的典型代表是紫羅蘭酮和大馬酮,因其具有特殊的香氣,在食品、發酵酒、香料、煙草等行業占有重要地位。類胡蘿卜素是降異戊二烯香氣化合物的前體物,由于其經濟實用,已大量用于生產降異戊二烯化合物。類胡蘿卜素經過分解(裂解)能夠產生降異戊二烯化合物,極大地豐富產品的風味和香氣,特別對釀造類食品如果酒的香味貢獻極大,可以大大提升果酒的香味和品質,因此,研究類胡蘿卜素的生物降解產香有重要的現實意義和巨大的應用前景。?
微生物產香是目前國際上改進香料生產技術和改善發酵食品香氣品質的新型研究領域,但目前的研究水平大多還停留在產香微生物篩選及產香特征的研究,關于類胡蘿卜素降解酶的研究報道也大多來自植物源降解酶,而且集中在異源表達酶的純化和粗酶的簡單純化(通過等電點),關于微生物酶的研究極少,而關于純化類胡蘿卜素降解酶的方法也很少。利用微生物酶進行生產可有效簡化生產工藝,降低生產成本;類胡蘿卜素降解酶更容易作為食品調香助劑在食品生產中得到廣泛應用。但廣泛應用微生物酶的前提是能得到廉價且具有一定數量的酶。現有研究表明,大多數具有類胡蘿卜素降?解能力的微生物產生降解酶的能力較差,酶的產量十分低,從微生物培養物中分離純化一定數量且能用于生產的酶難度極大,成本極高。?
發明內容
本發明的目的在于,提供一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法,該方法對樣品的前處理簡單,操作方便,可重復性高,能得到純度達95%的純酶。?
為了實現上述任務,本發明采取如下的技術解決方案:?
一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法,其特征在于,該方法采用蛋白純化系統和高效液相色譜法對β-胡蘿卜素降解酶進行純化,利用高效液相色譜法對其純度進行鑒定,并算出該酶純化每一步的酶活和比活力,具體按下列步驟操作:?
1)在改良查氏培養基(液體查氏培養基中添加0.3%的酵母浸粉)中培養葡萄球菌,培養條件為:37℃,恒溫培養24h;?
2)培養結束后,將發酵液于10000r?min-1冷凍離心20min,取上清得粗酶液,冷凍、干燥、濃縮粗酶液至規定的濃度,取濃縮液過0.22μm有機系濾膜,得上樣:?
3)純化:?
純化分三步:?
第一步是離子交換,上樣于蛋白純化系統,條件:強陰離子柱MONO?Q10/100GL,選擇合適的緩沖液進行線性洗脫,選擇三個波長同時檢測,收集具有降解β-胡蘿卜素能力的活性成分;?
第二步,將上述得到的活性成分進高效液相色譜進行進一步分離,純化條件:半制備色譜柱C18,選擇合適柱溫,以及合適流動相進行梯度洗脫,選擇相應波長檢測,將具有降解β-胡蘿卜素能力的活性峰收集,冷凍干燥濃縮;?
第三步,上樣于蛋白純化系統,條件:多肽分子篩Superdex?peptide?10/300column,選擇合適的緩沖液洗脫,選擇三個波長同時檢測,收集目標峰,濃縮,重新上樣于多肽分子篩,同樣的條件再次純化收集目標峰,濃縮進HPLC進行檢測;?
采用分析液相檢測純度的條件:色譜柱C18,選擇合適的柱溫及其合適的流動相洗脫,選擇相應的波長檢測;?
將底物β-胡蘿卜素配制成胡蘿卜素儲備液,并建立β-胡蘿卜素溶液濃度與吸光值的標準曲線,用以計算β-胡蘿卜素降解酶的酶活和比活力。?
上述改良查氏培養基是在查氏培養基加入質量濃度為0.3%酵母浸粉,以適應巴氏葡萄球菌的生長。?
上述離子交換中的緩沖液為:?
A液:20mM醋酸鈉-醋酸溶液(pH5.0),B液:20mM醋酸鈉緩沖液中加1mol?l-1氯化鈉;?
所述線性洗脫為:上樣量為2ml;流速1ml/min;洗脫程序為:?
0-30min,A液洗脫;30-70min,0-50%B液線性洗脫;70-80min,50%B液洗脫;80-110min,100%B液洗脫;檢測波長為280nm,254nm和215nm。?
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