[發明專利]一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法

無效

• 申請號: 201310500511.5
• 申請日: 2013-10-22
• 公開（公告）號: CN103555684A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 樊明濤;朱明明;王樹林
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N9/02;C12R1/44
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法，其特征在于，該方法采用蛋白純化系統和高效液相色譜法對β-胡蘿卜素降解酶進行純化，利用高效液相色譜法對其純度進行鑒定，并算出該酶純化每一步的酶活和比活力，具體按下列步驟操作：

1）在改良查氏培養基中培養葡萄球菌，培養條件為：37℃，恒溫培養24h；

2）培養結束后，將發酵液于10000r?min^-14℃離心20min，取上清得粗酶液，冷凍、干燥、濃縮粗酶液至規定的濃度，取濃縮液過0.22μm有機系濾膜，過濾液用于進一步純化酶；

3）純化：純化分三步：

第一步是離子交換，上樣于蛋白純化系統，條件：強陰離子柱MONO?Q10/100GL，選擇合適的緩沖液進行線性洗脫，選擇三個波長同時檢測，收集具有降解β-胡蘿卜素能力的活性成分；

第二步，將上述得到的活性成分進高效液相色譜進行進一步分離，純化條件：半制備色譜柱C₁₈，選擇合適柱溫，以及合適流動相進行梯度洗脫，選擇相應波長檢測，將具有降解β-胡蘿卜素能力的活性峰收集，冷凍干燥濃縮；

第三步，上樣于蛋白純化系統，條件：多肽分子篩Superdex?peptide10/300column，選擇合適的緩沖液洗脫，選擇三個波長同時檢測，收集目標峰，濃縮，重新上樣于多肽分子篩，同樣的條件再次純化收集目標峰，濃縮進HPLC進行檢測；

采用分析液相檢測純度的條件：色譜柱C₁₈，選擇合適的柱溫及其合適的流動相洗脫，選擇相應的波長檢測；

將底物β-胡蘿卜素配制成胡蘿卜素儲備液，并建立β-胡蘿卜素溶液濃度與吸光值的標準曲線，用以計算β-胡蘿卜素降解酶的酶活和比活力。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良查氏培養基是在查氏培養基加入質量濃度為0.3%的酵母浸粉。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述離子交換中的緩沖液為：

A液：20mM醋酸鈉-醋酸溶液，pH5.0；

B液：20mM醋酸鈉緩沖液中加1mol?l^-1氯化鈉；

所述線性洗脫為：上樣量為2mL；流速1mL/min；洗脫程序為：

0-30min，A液洗脫；

30min-70min，0-50%的B液線性梯度洗脫；

70min-80min，50%B液洗脫；

80min-110min，100%B液洗脫；

上述的檢測波長為280nm，254nm和215nm。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流動相為：

A液：20mM醋酸鈉-醋酸溶液，pH5.0；

B液：乙腈；

所述梯度洗脫為：上樣量5mL；流速5mL/min；洗脫程序為：

初始流動相A：B的比例為77.5：12.5，20min時，流動相A：B的比例為50：50，25min時，流動相A：B的比例為40：60，35min時，為100%B液，40min時，流動相A：B的比例為77.5：12.5，柱溫30℃，檢測波長為280nm，254nm和215nm。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽分子篩Superdex?peptide10/300column的緩沖液為蒸餾水；上樣量500μL；流速0.5mL/min；檢測波長為280nm，254nm和215nm；檢測時間為70min。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析液相的流動相為：

A液：20mM醋酸鈉-醋酸溶液，pH5.0，B液：乙腈；上樣量20μL；流速1mL/min；檢測波長為280nm，254nm和215nm；柱溫：30℃；檢測時間為10min。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標準曲線的建立為：首先準確稱取5mgβ-胡蘿卜素標準品，溶解于10mL的二氯甲烷，并加入1g的Tween-80，在通風櫥中旋轉使其二氯甲烷揮發至干，加入50ml蒸餾水即為β-胡蘿卜素儲，備液于4℃保存；

分別取20μL，40μL，60μL，80μL，100μL儲備液定容至3.25mL，以蒸餾水為空白，調零于460nm波長處測其吸光值，用所得數據作圖可得β-胡蘿卜素溶液濃度與吸光值的標準曲線。